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背景:慢性髓细胞白血病(chronic myelogenous leukemia)是来自骨髓多能干细胞异常克隆的恶性血液病;目前化学治疗是CML慢性期的主要治疗手段。然而,导致化疗失败和复发的主要因素之一是白血病细胞出现多药耐药性(multidrug resistant)。其中MDR1基因/P-糖蛋白(P-gp)是白血病MDR的研究领域中一个非常流行的重要课题。Bmi-1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1)是多梳基因家族(Polycomb Group genes,Pc G)的关键成员之一。Bmi-1作为一种原癌基因与各种癌症的发生和进展有非常紧密的关联,包括恶性血液病。然而,关于Bmi-1与白血病多药耐药现象相关方面传导通路及具体生物学机制仍不明确。因此,本次实验内容把CML的多药耐药细胞系K562/ADR作为主要研究对象,探究Bmi-1是否参与到CML的多药耐药中,并且希望进一步探讨这一现象的可能生物学机制。方法:1、利用慢粒的多药耐药细胞株K562/ADR,使用RNA干扰方法即使用实验室已构建好的两种序列小干扰RNA瞬时转染K562/ADR细胞48小时(A-S1,A-S3),干扰Bmi-1基因的表达。2、沉默Bmi-1基因的表达后检测PTEN,p-AKT,NF-ΚB细胞浆及细胞核P65(NF-κB P65 in nuclear and P65 in cytoplasm),P-gp的蛋白表达及MDR1/P-gp的功能改变。3、应用NF-κB抑制剂PDTC,80μmol/l处理K562/ADR细胞24小时,抑制NF-κB后,检查P-gp的蛋白表达及其功能变化。4、应用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002,20μmol/l处理K562/ADR细胞24小时,抑制p-AKT后,检测NF-κB胞浆及胞核P65与P-gp的蛋白表达。5、沉默Bmi-1基因后使用PTEN抑制剂BPV(phen),80nmol/l处理细胞4小时,检测p-AKT,NF-κB细胞浆及细胞核P65蛋白与P-gp的表达。使用倒置荧光显微镜观测K562/ADR细胞转染控制组(A-C)质粒的效率。Bmi-1和MDR1基因m RNA的表达通过RT-PCR进行分析。不同组别的各种蛋白表达水平经过Western Blot实验测定。MDR1/P-gp的药物泵出功能应用流式细胞分析仪进行检测。结果:1、两种小干扰RNA敲除Bmi-1基因的表达后,都能够抑制NF-κB信号通路(P65 in cytoplasm升高,P65 in nuclear降低)以及降低MDR1/P-gp的表达。Bmi-1-RNA干扰,增加了阿霉素在K562/ADR中的积聚即说明抑制了MDR1/P-gp药物泵出功能。2、NF-κB的活性和P-gp的蛋白表达及MDR1/P-gp药物泵出功能在使用NF-κB抑制剂(PDTC)后被抑制。3、敲除Bmi-1基因后,增加了PTEN的表达,抑制了磷酸化AKT。4、丝氨酸473位点p-AKT和NF-κB-P65在细胞核的表达量,以及P糖蛋白的表达在应用PI3K/AKT途径抑制剂LY294002时表现出显著减少。5、在K562/ADR-Bmi-1-si RNA细胞中应用PTEN抑制剂BPV(phen)处理时,NF-κB的活性及P-gp的表达得到重塑。结论:1、Bmi-1可能在MDR1/P-gp介导的K562/ADR细胞多药耐药中起关键作用。2、Bmi-1参与K562/ADR多药耐药可能是通过核因子NF-κB及PTEN/PI3K/AKT通路介导的。