论文部分内容阅读
目的:缺血性心脏病引起的死亡率居全球首位,恢复缺血区血流势必会引起缺血/再灌注损伤这一严重并发症,导致心肌线粒体损伤、钙超载和严重的心肌细胞凋亡,造成心脏不可逆的损伤和功能障碍。甲状腺激素可促进心脏损伤后的心功能恢复,然而其中可能存在的分子机制尚不清楚。激活Akt信号通路可以减少细胞凋亡、维持细胞的线粒体功能,并调节心肌细胞各种离子通道的表达。本文旨在探讨新生乳鼠心肌细胞受到缺氧/复氧损伤后,甲状腺激素T3对心肌细胞的影响及PI3K/Akt信号通路在其中的作用。方法:取1-2天乳鼠,分离培养心肌细胞,分别采用不同浓度T3（0,20,40和80μM）预处理心肌细胞24h后,对细胞进行缺氧5h及复氧24h处理,建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,研究不同浓度T3对心肌细胞缺氧/复氧损伤后的作用。将培养的心肌细胞分为5组,即正常对照组（Control）、缺氧/复氧组（H/R）、缺氧/复氧+T3组（H/R+T3）、缺氧/复氧+T3+PI3K/Akt通路阻滞剂组（H/R+T3+LY294002）、缺氧/复氧+通路阻滞剂组（H/R+LY294002）。T3预处理24h后,对细胞进行缺氧/复氧处理。LY294002为特异性PI3K/Akt信号通路阻滞剂,预处理24小时可阻滞PI3K/Akt信号通路。采用Annexin-V FITC/PI双染及流式细胞技术检测心肌细胞凋亡情况,JC-1染色检测细胞线粒体膜电位变化,western blot检测凋亡蛋白（Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3）、信号通路（PI3K、Akt）及SERCA2a、NCX1的表达。结果:（1）与正常培养细胞相比,T3预处理能减少缺氧/复氧损伤导致的细胞死亡,且这一作用呈浓度依赖性,T3浓度为60μM时能显著增加心肌细胞活性,而高浓度T3（80μM）则表现出心肌细胞毒性作用,心肌细胞活性下降。（2）Western Blot结果显示,与正常细胞相比,缺氧/复氧损伤增加心肌细胞cleaved Caspase-3和Bax蛋白的表达,Bcl-2蛋白表达明显下降,且心肌细胞凋亡率显著增加（40.47%vs 7.61%,P（27）0.01）;而T3预处理可以显著降低缺氧/复氧损伤导致的心肌细胞凋亡（28.41%vs 40.47%,P（27）0.05）,且T3预处理增强了Bcl-2表达,并使Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达下降（P（27）0.01）。然而,当加入LY294002时,心肌细胞凋亡率显著增加（43.66%vs 28.41%,P（27）0.05）,且心肌细胞Bcl-2蛋白表达下降,Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达显著增加（P（27）0.05）。（3）与正常培养细胞相比,缺氧/复氧损伤导致细胞线粒体膜电位下降,绿/红荧光比明显增加（P（27）0.05）,T3预处理可减轻缺氧/复氧损伤导致的细胞线粒体膜电位的下降,绿/红荧光比显著下降（P（27）0.05）。当加入LY294002时,心肌细胞线粒体绿/红荧光比明显增加（P（27）0.05）,线粒体膜电位显著下降。（4）与正常培养细胞相比,缺氧/复氧损伤降低了心肌细胞L-型Ca2+通道电流（6.97±0.485 p A/p F vs 14.62±1.357 p A/p F,P（27）0.05）,I-V曲线上移,半数失活电压减小,失活曲线右移,半数激活电压增大,激活曲线左移;T3预处理可增加缺氧/复氧损伤后细胞L-型Ca2+通道电流密度（10.66±0.719 p A/p F vs 6.97±0.485 p A/p F,P（27）0.05）,并能恢复左移的激活曲线,使激活减慢,恢复右移的失活曲线,使失活加快;当加入LY294002时,心肌细胞L-型Ca2+通道电流密度明显减小（3.264±0.24 p A/p F,P（27）0.05）,细胞L-型Ca2+通道的激活曲线左移,激活加快,其失活曲线右移,失活减慢。（5）与正常培养细胞相比,缺氧/复氧损伤增强了心肌细胞钠钙交换蛋白（NCX1）的表达,同时SERCA2a蛋白的表达降低（P（27）0.05）。然而,T3预处理显著降低了NCX1蛋白的表达,增加了SERCA2a蛋白表达（P（27）0.05）。LY294002明显抑制了SERCA2a蛋白的表达,增强了NCX1蛋白的表达（P（27）0.05）。（6）与正常培养细胞相比,缺氧/复氧损伤可增加PI3K的磷酸化（P（27）0.01）,但并没有显著增加磷酸化Akt的表达;T3预处理显著增加了P-PI3K、P-Akt的表达（P（27）0.05）,即T3激活了PI3K/Akt信号通路。当加入PI3K/Akt通路阻滞剂LY294002时,T3的这一作用被显著抑制,P-PI3K、P-Akt的表达显著下降（P（27）0.05）。结论:（1）乳鼠心肌细胞进行缺氧/复氧损伤后,可导致心肌细胞凋亡坏死,T3预处理可显著增加心肌细胞存活率,抑制心肌细胞凋亡,减少凋亡蛋白cleaved Caspase-3、Bax的表达,起到抗凋亡作用。（2）T3预处理可以降低缺氧/复氧损伤导致的心肌细胞线粒体膜电位下降,增加心肌细胞Bcl-2/Bax的表达,保护心肌细胞线粒体功能。（3）T3预处理可以减少缺氧/复氧损伤对心肌细胞L-型Ca2+通道电流的抑制,维持心肌细胞L-型Ca2+通道电流大小;T3预处理还能降低缺氧/复氧损伤导致的NCX1表达增加,并增加SERCA2a蛋白的表达,从而减轻细胞内钙超载,保护心肌细胞。（4）T3可激活PI3K/Akt信号通路,LY294002可以抑制T3对心肌细胞的保护作用,说明T3对缺氧/复氧诱导的心肌细胞的保护作用是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。