银杏种仁抑菌蛋白及其抑菌机制研究

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以银杏种仁为原料,研究了银杏种仁蛋白的抑菌活性及其抑菌机制,分析了其性质、组成及结构,为天然食品防腐剂的开发及银杏种仁的综合利用提供参考。主要研究结果如下:(1)银杏种仁中主要存在酚酸、多糖及蛋白3种抑菌活性物质。银杏种仁酚酸主要由羟基侧链为C13:0、C15:1、C17:2、C15:0、C17:1的5种组分组成,对E.coli、B.subtilis2种细菌及Penicillium1种真菌的抑菌活性较强,最小抑菌浓度分别为7.5mg/mL、15mg/mL、25mg/mL。银杏种仁多糖(50~80%醇沉级分)为一种含有87.4%多糖和1.03%蛋白的复合糖蛋白,分子量约40kDa,该多糖对B.subtilis有较强的抑菌活性,MIC为50mg/mL,但对真菌几乎无抑菌活性。银杏种仁蛋白(40~80%硫酸铵沉淀级分)对革兰氏阳性及阴性细菌均有抑菌活性,其中对K.peneumoniae的抑菌活性最强,MIC为100mg/mL,同时对Penicillium, T.delbrueckii,A.niger等3种真菌的MIC均为100mg/mL,具有广谱抑菌性。(2)采用磷酸缓冲液提取银杏种仁蛋白,以蛋白提取率为指标,采用响应面分析法探讨料液比、提取液浓度及提取时间等因素对蛋白提取率的影响,结果表明料液比、提取液浓度及提取时间均对蛋白提取率有极显著影响(P<0.01),且三者间交互作用均对蛋白质的提取率有显著影响(P<0.05),蛋白提取的最佳工艺条件为液料比20mL/g,提取液浓度0.07mol/L,提取时间14h,在此条件下,蛋白质一次提取率为86.58%,结果在可信度分析范围之内。(3)以K.peneumoniae、S.aureus2种细菌及T.delbrueckii、A.niger2种真菌为供试菌,依次采用硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-Cellulose52阴离子交换柱层析及Sephadex G-75凝胶过滤柱层析对银杏种仁蛋白进行纯化,确定适宜的硫酸铵饱和度为40%~80%,纯化得到1个抑菌活性最强的蛋白峰,命名为GBSP-A。GBSP-A对4种菌的最小抑菌浓度分别为20mg/mL、20mg/mL、20mg/mL及12mg/mL; SDS-PAGE显示该纯化蛋白为单一条带,表观分子量为41.8kDa, Schiff染色结果表明其为糖蛋白,蛋白与糖的比例为70﹕1;Superdex G-75柱层析结果显示GBSP-A呈单一对称峰,高效液相凝胶过滤色谱(HPGPC)检测其分子量为39.316kDa。(4)对GBSP-A的结构进行了表征,β-消去反应表明该糖蛋白的糖肽键类型为O-糖苷键,红外分析表明其为同时含有α-和β-糖苷键的吡喃糖蛋白化合物,刚果红试验表明其中的糖链不含3股螺旋,LC-MS-MS分析表明该蛋白与银杏中的一种11S结合蛋白(ginkbilobin-2precursor)匹配率很高,共得到10个匹配肽段序列,通过CAMP抗菌肽数据库对该蛋白肽片段进行氨基酸序列比对,发现此蛋白为一种新的抑菌蛋白。(5)理化性质研究表明,GBSP-A不含淀粉、游离多糖及游离氨基酸,具有蛋白质及多糖典型性反应特点,在220nm及280nm处有紫外吸收峰。该蛋白对pH、热及NaCl盐溶液较为稳定,DSC扫描结果表明其热变性温度为63.7℃。氨基酸组成分析表明,GBSP-A至少含有16种氨基酸,其中天门冬氨酸(Asp,7.269%)含量最高,对蛋白质稳定性有重要影响的疏水性氨基酸含量占总氨基酸的36.2%。(6)以K.peneumoniae及S.aureus为供试菌,探讨了银杏种仁抑菌蛋白(GBSP-A)对供试菌生长发育的影响,结果表明,GBSP-A能抑制K.peneumoniae(G-)及S.aureus(G+)的生长,使其生长曲线发生改变,异于正常菌体的繁殖趋势;扫描电镜及透射电镜观察显示GBSP-A处理后的供试菌菌体细胞壁膜融解、消失,细胞质泄漏,并最终崩解,导致菌体死亡;对细胞膜渗透性的研究表明,GBSP-A处理后,供试菌菌悬液的电导率升高,Na+及其它大分子物质大量泄漏,胞外β-半乳糖苷酶活性升高。抑菌蛋白还能增加菌体细胞表面的电负性及疏水性,从而使其更易絮凝、沉淀,并最终死亡。(7)以K.peneumoniae及S.aureus为供试菌,研究了银杏种仁抑菌蛋白对细菌呼吸代谢的抑制途径以及对蛋白质、DNA、ATP含量和几种相关酶活性的影响。结果表明,抑菌蛋白对供试菌的呼吸代谢会产生一定的抑制作用,但并不是通过TCA、EMP及HMP中的任何代谢途径来发挥作用;抑菌蛋白会抑制菌体内蛋白质、DNA的合成及ATP的产生,但并不能抑制菌体内任何一种蛋白质的表达,也不能使DNA发生断裂;抑菌蛋白会使菌体内ATP酶、β-半乳糖苷酶及碱性磷酸酶的产生量降低,进而影响到菌体正常的生理代谢。同时,抑菌蛋白浓度对菌体代谢的抑制作用没有显著量效关系。
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