模块化聚酮合酶（Modular polyketide synthase,mPKS）是自然界中功能强大的生物合成装配线,负责一大类结构复杂、活性多样的聚酮天然产物的合成。在其催化聚酮链延伸的过程中,酰基载体蛋白（Acyl-carrier protein,ACP）将合成前体或中间体运送到各个催化结构域,完成特定的化学反应,因此ACP和催化结构域之间特定的蛋白相互作用是mPKS正常行使功能的基础,但mPKS的催化机制决定了这种相互作用是瞬时可逆的,难以捕捉分析。酮基还原酶（Ketoreductase,KR）结构域负责将聚酮中间体的b-酮基还原成D-或L-型的羟基,部分KR还可以将D-型的a-甲基异构化为L-型。前人的研究表明KR和ACP间正常的蛋白相互作用对a-甲基和b-羟基手性中心的形成非常重要,在KR还原缺少ACP的底物类似物（如乙酰半胱氨（N-acetyl cysteamine,SNAC）衍生的底物）时产物常常是外消旋的混合物。因此,揭示二者间的蛋白相互作用可以为定向改造KR获得具有特定立体构型的产物奠定基础。为了获得ACP和KR相互作用的蛋白复合物,本研究首先尝试通过反应活性相同、长度不同的三种双功能马来酰亚胺试剂,即Bismaleimidoethane（BMOE）,1,4-bismaleimidobutane（BMB）,和Bismaleimidohexane（BMH）,对单独表达的KR和ACP结构域进行共价交联尝试,但并未发现明显交联复合物生成。由于ACP与KR之间的亲和力仅能达到微摩尔级别,单结构域交联不成功的可能原因是在自由环境下二者相对浓度过低,发生结合的概率也较低,ACP的磷酸泛酰巯基乙胺臂（Phosphopantetheine,Ppant）难以自主进入KR的底物结合孔道。考虑到在PKS的大多数模块中,KR与ACP是通过一个柔性多肽融合在一起的,直接表达Amp（KR+ACP）2融合蛋白可以提高二者的相对浓度;同时,为了方便交联结果的检测,在二者的连接多肽间插入一个烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus,TEV）蛋白酶切位点。双结构域的融合蛋白与交联剂进行共同孵育,随后TEV酶切检测交联结果,成功实现KR和ACP的共价交联。调整孵育时间、温度、蛋白和BMH反应浓度等反应条件,使交联效率最大化。在不同的最优反应条件下,这一交联策略可运用于多个KR和同源ACP的瞬时复合物捕获,表明这一策略具备一定通用性。根据KR-ACP交联复合物与体系内其它蛋白在分子量和所携带标签上的差异,结合亲和层析和凝胶过滤等纯化手段,建立了两种分别适用于单标签和双标签融合蛋白的复合物纯化方案。若参与交联反应的蛋白本身在仅C端携带单标签的情况下便可正常表达纯化,可采用单标签纯化方案进行交联复合物的纯化,所得产物纯度较高、状态较稳定,可用于后续晶体结构解析。若参与交联反应的蛋白须得在N端携带标签才能正常表达纯化,则需额外在C端添加另一小标签以便后续交联复合物的纯化,本研究已尝试并验证的小标签有Strep、Flag和HA三种。其中,融合蛋白C端分别携带Strep-tag和Flag-tag时,所得交联终产物中均含有少量未交联KR杂质;C端携带HA-tag时,所得交联终产物出现轻微降解现象。本研究建立的双结构域共价交联策略可成功捕获聚酮合酶中酮基还原酶和同源酰基载体蛋白相互作用的瞬时复合物;开发的蛋白复合物纯化方案可获得适用于晶体结构初筛的KR-ACP蛋白复合物,为后期晶体结构的解析、KR与ACP相互作用机理的揭示及参与相互作用的关键氨基酸的鉴定提供了实验基础。