研究背景脓毒症是宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的炎症反应综合征,它的病理生理过程复杂,临床症状多样,耗费了大量的医疗资源。患者一旦发生脓毒症后预后较差。遗憾的是,我们对脓毒症疾病机制尚未完全明确且缺乏有效治疗手段。近年来,较多研究表明血管屏障功能的破坏在脓毒症的发生发展中扮演推动作用。已知血管内皮细胞的完整性是维持血管屏障功能的关键因素之一。内皮细胞的功能障碍引起屏障功能的破坏,后者会导致血管通透性的增高和血管内物质渗漏到组织间隙,导致组织水肿和器官功能障碍。脓毒症引起急性肺损伤时,血管内皮细胞受损,肺微血管渗漏增加及干湿比增高,而稳定内皮细胞的连接可减轻脓毒症后肺损伤并降低脓毒症患者死亡率。有研究证实,革兰氏阴性细菌细胞壁来源的脂多糖(lipopolysacchride,LPS)可以通过损伤内皮细胞,导致血管内皮屏障功能障碍,使血液中多种炎性因子、补体、蛋白质等大分子物质透过受损的内皮渗透到血管外,致使患者机体的有效循环血容量明显下降;但LPS导致脓毒症中的微血管内皮细胞屏障功能受损的机制仍不完全清楚。因此,从内皮屏障功能障碍的机制入手,可能为脓毒症的治疗提供潜在突破方向。内皮细胞的屏障功能依赖于多种因素,包括细胞跨膜途径以及细胞旁路途径。细胞旁路途径依赖于细胞与细胞间的连接和细胞骨架蛋白的收缩力之间的平衡,它包括了黏附连接和紧密连接的形式。其中,内皮特异性的黏附连接-血管内皮钙粘连蛋白的组装和构建先于紧密连接形成,在维持血管完整性和内皮功能上起重要作用。连环蛋白(Catenin)是一组与钙粘连蛋白(Cadherin)在细胞膜处起作用的粘附蛋白,包括α、β、γ等几种。β-catenin就在内皮细胞中大量表达,参与细胞的增殖、分化和凋亡等重要环节的调控。位于细胞膜上的β-catenin,在细胞骨架蛋白和E-cadherin的相互作用、同型细胞间的黏附性、运动性中起调节作用,维持细胞的黏附、防止细胞的移动。当黏附连接结构受损时,来自于F-actin形成应力纤维的向心力的骨架蛋白的收缩力,将大于细胞间的黏附力,两者间的平衡破坏,细胞间的间隙增加,通透性随之升高。因此,β-catenin蛋白的表达减少(下降)将破坏内皮细胞的旁路途径,导致内皮细胞的屏障破坏,而包括LPS在内的多种炎症因子都会对血管内皮屏障造成损伤,提示β-catenin蛋白减少促进了脓毒症后血管通透性增高。沉默信息调节因子 2 相关酶 1(silent information regulator 2 homolog 1,SIRT1)是最近发现的非常重要的组蛋白/非组蛋白的去乙酰化酶。到目前为止,SIRT1被广泛地研究。SIRT1主要通过去乙酰化目的蛋白,使其活性增加或者抑制,在调节细胞分化、细胞代谢、细胞周期、细胞凋亡和应激反应等过程中起到十分重要的作用。日益增多的证据表明,SIRT1的蛋白表达增加或者活性增强可以延长脓毒症动物模型的生存率,其作用可能与改善血管通透性等有关。有研究发现,SIRI1蛋白下调会加重脓毒症后的血管通透性增加。有意思的是,使用SIRT1的激动剂可以逆转LPS导致的血管通透性增加,提示SIRT1蛋白表达增加或激活可以减轻脓毒症后的血管通透性增加。然而,作为血管通透性的重要细胞内皮细胞,SIRT1在其中的作用尚未完全清楚且机制有待阐明。众所周知,p53是SIRT1去乙酰化修饰的第一个非组蛋白。p53蛋白在促进细胞凋亡和抑制肿瘤生长等多个领域起重要作用。p53蛋白受磷酸化和乙酰化等翻译后修饰的影响,其中p53乙酰化修饰导致p53活性增加。本课题组前期研究表明,严重失血性休克后SIRT1蛋白表达下降并活性下调,导致p53的去乙酰化增加,肾小管上皮细胞凋亡增加;而激活SIRT1可通过上调SIRT1-去乙酰化p53信号通路减少休克后的肾小管上皮细胞凋亡。其他学者有研究表明,SIRT1去乙酰化p53可以阻断缺氧-复氧、缺血、高血糖和剪切应激等氧化应激诱导的内皮细胞的老化及屏障功能的破坏。有研究表明p53可以下调β-连环蛋白(β-catenin)表达。值得注意的是,非应激细胞中基础水平的p53不会导致β-catenin蛋白下调,但在暴露于广泛的基因毒性应激下高水平活化的p53对β-catenin蛋白活性具有强烈的抑制作用。SIRT1去乙酰化p53后,会显著减低p53活性。因此我们推测,在LSP刺激模拟的脓毒症细胞模型中,去乙酰化酶SIRT1的失活导致p53乙酰化增加,促进β-catenin参与的黏附连接损伤,内皮细胞通透性增加,从而加重血管内皮屏障功能障碍;而SIRT1的表达或活性增加能够去乙酰化p53,从而扭转这个过程,保护β-catenin,减轻LPS诱导的血管内皮屏障功能障碍。研究目的本研究以C57小鼠和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为研究对象,探讨SIRT1是否通过去乙酰化p53抑制其对β-catenin表达的下调,从而保护黏附连接,对血管内皮屏障功能起到保护的作用,这将助于进一步阐明脓毒症介导的微血管内皮细胞通透性增高的作用机制,为脓毒症的内皮细胞屏障功能障碍的防治提供新的理论依据。研究方法本研究通过动物模型和细胞模型两部分展开,其中1为C57小鼠动物模型部分,2-6为人脐静脉内皮细胞模型部分。实验采用原代鉴定与分离、细胞培养技术、Western blot、免疫荧光、测跨单层内皮细胞电阻值(transendothelial electrical resistance,TER)和异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐(fluorescein isothiocyanate labelleddextran,FITC-dextran)的漏出系数、观察肠系膜微血管渗漏等方法,研究LPS作用下SIRT1的表达水平,和其对下游β-catenin表达、p53乙酰化的影响。采用SIRT1的特异性激动剂SRT1720或SIRT1特异性抑制剂EX527预处理细胞,分别增加或抑制SIRT1活性;采用SIRT1 siRNA下调SIRT1蛋白表达;免疫印迹方法检测SIRT1蛋白,β-catenin和乙酰化p53蛋白的水平;采用免疫荧光技术在共聚焦下观察细胞的β-catenin荧光水平和细胞内分布情况。应用电阻仪检测单层内皮细胞间的电阻值,应用FITC-dextran漏出法检测内皮细胞的渗漏,间接反映内皮的屏障功能。以C57小鼠为研究对象,颈静脉注入FITC-dextran,之后观察肠系膜中的微静脉 FITC-dextran 的渗漏情况,研究小鼠肠系膜微静脉的渗漏。本研究的数值采用平均值±标准误,使用社会科学统计软包(statistical package for the social science,SPSS)19.0软件分析数据,采用单因素方差分析(one-way analysisofvariance,ANOVA)分析组间的差异(方差齐性时采用LSD法,方差不齐时则采用Dunnect’s T3法),P<0.05提示有统计学差异。研究分组及结果1.激活SIRT1可减轻LPS诱导的肠系膜微血管内皮通透性的增高。构建脓毒症小鼠模型,探讨SIRT1对LPS诱导的肠系膜微血管内皮的影响。分成 Control 组,LPS+溶剂(LPS+Vehicle)组,LPS+SRT1720 组。其中 Control组注入生理盐水;LPS+Vehicle组则尾静脉注射与SRT1720等量的溶剂,2h后腹腔注入LPS;LPS+SRT1720组尾静脉注射SIRT1激动剂SRT1720(10mg/kg),2h后腹腔注入LPS。6h之后,小鼠颈静脉插管,在显微镜下寻找肠系膜微静脉,颈静脉注入FITC-dextran,之后观察肠系膜中的微静脉FITC-dextran的渗漏情况。结果:LPS刺激后血管通透性增加,表现为大量荧光渗出(P<0.05);而SIRT1激动剂SRT1720预处理则可以显著改善LPS致肠系膜微血管的渗漏增加。2.LPS刺激导致SIRT1蛋白水平下调的时间效应。使用为500 ng/mL的LPS刺激细胞,选择SIRT1蛋白测定的时间点分别为LPS 刺激后 1、2、4、8、12、24h。结果:1h后SIRT1的蛋白水平即出现明显下调(P<0.05),并且SIRT1蛋白的低水平表达维持至第24小时。3.激活SIRT1可减轻LPS诱导的β-catenin蛋白下调。构建脓毒症细胞模型,分别使用SIRT1的激动剂SRT1720和抑制剂EX527预处理细胞,探讨SIRT1对β-catenin蛋白的影响。激动剂组分成 Control 组,SRT1720 组,LPS+溶剂(LPS+Vehicle)组,LPS+SRT1720。抑制剂组分成 Control 组,EX527 组,LPS+溶剂(LPS+Vehicle)组,LPS+EX527组。Control组只对细胞进行与其余组一致的等量培养基更换;SRT1720组加入5 μmol/L的SIRT1激动剂SRT1720,处理内皮细胞24小时之后,更换培养基;EX527组加入20 μmol/L的SIRT1的抑制剂EX527,处理内皮细胞24小时之后,更换培养基;LPS+Vehicle组预先加入SRT1720或EX527药物所用溶剂(DMSO,分别至等量于SRT1720组或EX527组用量),24小时后给予500 ng/mL的LPS刺激1小时;LPS+SRT1720组则预先加入5 μmol/L的SIRT1激动剂SRT1720处理内皮细胞24小时,之后给予500ng/mL的LPS刺激1小时。LPS+EX527组则预先加入20 μmol/L的SIRT1抑制剂EX527处理内皮细胞24小时,之后给予500 ng/mL的LPS刺激1小时。免疫印记法和免疫荧光法测定β-catenin蛋白表达。结果:SIRT1激动剂SRT1720对正常细胞β-catenin蛋白水平无明显影响;SIRT1抑制剂EX527可诱导正常细胞β-catenin蛋白水平的下降(P<0.05);LPS刺激后细胞β-catenin蛋白水平下降(P<0.05);而SIRT1激动剂SRT1720预处理则可以显著改善LPS诱导的β-catenin蛋白水平下调(P<0.05)。SIRT1抑制剂EX527预处理可进一步加剧β-catenin蛋白水平的下降(P<0.05)。4.激活SIRT1可抑制LPS诱导的p53乙酰化水平增加。分组同3。测定p53乙酰化水平。结果:SIRT1激动剂SRT1720对正常细胞p53的乙酰化水平无影响;LPS刺激细胞导致p53的乙酰化水平升高(P<0.05);SIRT1激动剂SRT1720预处理可降低p53的乙酰化水平。5.抑制p53可减少LPS诱导的内皮细胞通透性的增高。分成Control组,PFT-α组(PFT-α是p53活性的抑制剂),LPS+溶剂(LPS+Vehicle)组,LPS+PFT-α组,除将预处理药物更换为p53的抑制剂PFT-α外,与3.1基本相同。PFT-α干预浓度为30μmol/L。检测细胞TER水平和FITC-dextran 渗漏。结果:p53抑制剂PFT-α不影响正常细胞的TER水平和FITC-dextran的渗漏程度;LPS刺激细胞导致TER水平降低,FITC-dextran渗漏增多(P<0.05);p53抑制剂PFT-α预处理可减少LPS导致的TER水平降低和FITC-dextran渗漏增多(P<0.05)。6.p53参与LPS诱导的β-catenin的下调。分组同5。免疫印记法测定β-catenin蛋白表达。结果:P53抑制剂PFT-α对正常细胞β-catenin蛋白水平无明显影响;p53抑制剂PFT-α预处理则可以抑制LPS诱导的β-catenin蛋白水平下调(P<0.05)。结论去乙酰化酶SIRT1激活可减轻LPS刺激后增加的内皮细胞的通透性,机制和SIRT1去乙酰化p53从而抑制其活性,进而减少β-catenin蛋白下调有关。