目的：凝血因子Ⅷ(FⅧ)、凝血因子Ⅸ (FIX)和D-二聚体检测是临床常用的血栓与止血检验项目,目前国内部分实验室FⅧ FⅨ和D-二聚体检测结果的准确性和可比性较差,需要研制参考物质以帮助其实施质量改进。为此,卫生部临床检验中心研制了4个批号的FⅧ和FIX活性检测参考物质和5个批号的D-二聚体定量检测参考物质,本课题对参考物质进行了评价和定值研究,同时对FⅧ FⅨ和D-二.聚体检测的一致化相关问题进行了探讨,以期为临床实验室实施质量改进提供帮助。方法：1.FⅧ和FIX活性检测参考物质的评价和定值：依据ISO Guide35《标准样品定值的一般原则和统计方法》,CNAS-GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》和CLSIEP-30《参考物质定值和互通性评价指南》的要求,对参考物质的均匀性、稳定性和互通性进行评价。依据JJG 1006-94《一级标准物质技术规范》和ISO Guide35《标准样品定值的一般原则和统计方法》的要求,采用多家实验室联合定值的方式,以NIBSC凝血标准品(LOT4)为溯源标准,由8家实验室使用3种检测系统(Sysmex、 Stago和IL)对参考物质进行定值。2.FⅧ和FIX活性检测结果一致化相关问题研究：①检测系统性能验证：参照文献及指南文件,结合厂家建议及专家意见制订性能验证方案,对STA-R Evolution血凝仪FⅧ和FⅨ活性检测的性能(包括批内精密度、日间精密度、正确度和线性)进行验证。②参考物质室内质控试应用：将参考物质应用于室内质控,计算检测结果的均值、标准差和累积变异系数(CV),并与进口配套质控物的检测结果进行比较,评价其室内质控应用效果。③不同系统检测结果可比性及校准模式研究：依据EP9-A2,对Stago和Sysmex系统FⅧ和FⅨ活性检测结果的可比性进行评价；分别以LOT4定标,高值参考物质定标和4个批号参考物质联合定标的方式对Stago和Sysmex系统进行校准,比较不同校准条件下系统间检测结果的可比性变化,探讨最佳校准模式。3.D-二聚体检测参考物质的评价和定值：依据ISO Guide35《标准样品定值的一般原则和统计方法》,CNAS-GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》和CLSIEP-30《参考物质定值和互通性评价指南》的要求,对临检中心研制的参考物质的均匀性、稳定性和互通性进行评价。依据JJG 1006-94《一级标准物质技术规范》和ISOGuide 35《标准样品定值的一般原则和统计方法》的要求,采用8家实验室联合定值的方式,使用3种以FEU为报告单位的检测系统(Sysmex、Stago和Vidas)对参考物质进行定值。’4.D-二聚体检测结果一致化相关问题研究：①检测系统性能验证：参照相关指南文件,结合厂家建议及专家意见制订性能验证方案,对Stago STA-R Evolution全自动血凝仪D--聚体检测的批内精密度、日间精密度和检测线性进行验证。②参考物质室内质控试应用：将参考物质应用于室内质控,计算检测结果的均值、标准差和累积变异系数(CV),并与进口配套质控物进行比较,评价其室内质控应用效果。③不同系统检测结果可比性及校准模式研究：依据CLSI EP9-A2,对Stago和Sysmex系统D-二聚体检测结果的可比性进行评价；分别以高值参考物质定标和5个批号参考物质联合定标的方式对Stago和Sysmex系统进行校准,比较不同校准条件下系统间检测结果的可比性变化,探讨最佳校准模式。结果：1.FⅧ和FIX活性检测参考物质的评价和定值：各批号FⅧ和FⅨ参考物质均匀性评价单因素方差分析结果均P>0.05,表明参考物质均匀性良好；FⅧ和FⅨ活性检测的瓶间均匀性不确定度(ubb)分别为0.5%～2.9%和0.1%-3.9%。将参考物质置于-80℃条件下保存,在评价期限内(9个月)FⅧ和FⅨ活性检测结果无趋势性变化,表明参考物质稳定性良好；其长期稳定性不确定度(ults)分别为0.5%-5.1%和0.8%-4.4%。各批号参考物质在Sysmex、Stago和IL三种检测系统间均具有互通性。定值检测结果经离群值检验、等精度检验和正态性检验后,4个批号FⅧ和FⅨ活性检测参考物质分别以8、8、8、6家和8、7、8、7家实验室的检测结果均值为定值结果,定值过程不确定度(Uchar)分别为0.7%-2.4%和0.4%～2.4%。合成并扩展不确定度后(扩展因子k=-2),4个批号参考物质FⅧ活性定值结果分别为(85±13)%、(36±4)%、(20±3)%和(6±2)%,FIX活性定值结果分别为(102±13)%、(48±7)%、(29±±4)%和(10±2)%。2.FⅧ和FIX活性检测结果一致化相关问题研究：①性能验证结果显示FⅧ和FⅨ活性检测批内及日间精密度均在厂家要求范围内；正确度验证结果显示FⅧ和FⅨ结果与靶值间的偏倚分别为-5.0%和12.7%；线性回归方程相关系数R2均>0.99,FⅧ活性检测在10.3%-149.6%范围内的线性验证通过,FIX活性检测在16.7%～200.2%范围内的线性验证通过。②将参考物质用于室内质控,FⅧ和FⅨX活性检测结果CV分别为3.1%-4.5%和4.3%～5.6%,均相近于商品质控物CV(6.4%-6.9%和5.0%～7.8%)。③对于Stago STA-R Evolution和Sysmex CS5100两系统,比对FⅧ活性检测结果范围为1.3%～123.1%的40份临床标本,结果显示其相关性R2=0.95,以相对偏差±30%(当浓度水平>12%时)或绝对偏差±±3%(当浓度水平≤12%时)为可接受标准,85%偏差结果在可接受范围内。系统间的绝对偏差范围和相对偏差分别为-3.8%～0(均值≤12%时)和-18.0%-46.8%(均值>12%时)。比对FⅨX活性检测结果范围为3.40%～147.6%的37份临床标本,结果显示其相关性R2=0.95,84%标本偏差在可接受范围内。系统间的绝对偏差范围和相对偏差范围为1.5%～2.6%(均值≤12%时)和当-17.6%-40.4%(均值>12%时)。分别用LOT4、高值参考物质校准和4个批号参考物质联合校准后,FⅧ临床标本相关性方程R2值均为0.94；相应的FⅨ临床标本相关性方程R2值均为0.96。LOT4、高值参考物质校准和4个批号参考物质联合校准后,FⅧ可比性允许结果数分别为95%、88%和90%,当均值≤12%时,三种校准模式下FⅧ系统间绝对偏差范围分别为-3.8%～0、-5.4%～0.8%和-5.1%～1.4%,当均值>12%时,相对偏差范围分别为-29.9%～30.4%、-42.1%～21.0%和-33.3%～21.9%。FⅨ可比性允许结果数分别为92%、95%和95%,当均值≤12%时,系统间的绝对偏差分别为0.1%～3.1%、-0.6%～2.3%和-0.7%～2.4%,当均值>12%时,相对偏差范围分别为-21.6%～36.0%、-33.1%～26.7%和-31.3%～28.5%。3.D-二聚体检测参考物质的评价和定值：D-二聚体各批号参考物质均匀性评价单因素方差分析结果均P>0.05,表明参考物质均匀性良好;其瓶间均匀性不确定度(ubb)范围为0.001%～0.033%。将参考物质置于-80℃保存条件下,在评价期限内(11个月)D-二聚体检测结果无趋势性变化,表明参考物质稳定性良好；其长期稳定性不确定度(ults)分别为0.011%～0.104%。各批号参考物质在Sysmex、Stago和Vidas三种检测系统间均具有互通性。定值检测结果经离群值检验、等精度检验和正态性检验后,5个批号D-二聚体定量检测参考物质分别以6、6、7、8和7家实验室的检测结果均值为定值结果,定值过程不确定度(uchar)分别为0.011%～0.096%。合成并扩展不确定度后(扩展因子k=-2),5个批号参考物质定值结果分别为：(0.27±0.04)mg/L、(0.35±0.04)mg/L、(0.58±0.06)mg/L、(2.01±0.19)mg/L和(2.79±0.30)mg/L。4.D-二聚体检测结果一致化相关问题研究：①性能验证结果显示D-二聚体检测批内及日间精密度均在厂家和国家行业标准要求范围内；线性回归方程相关系数R2>0.99,检测在0.26mg/L～3.96mg/L区间内线性验证通过。②将参考物质用于室内质控,其CV分布范围为2.5%～13.7%,相近于商品质控物CV(1.7%～14.8%)。③对于Stago STA-R Evolution和Sysmex CA1500两系统,比对D-二聚体检测结果范围为0.18mg/L～3.69mg/L的38份临床标本,结果显示系统间相关性R2=0.95。可比性评价中95%结果在可接受范围内(浓度≤0.50mg/L时绝对偏差小于0.25mg/L；浓度>0.50mg/L时相对偏差<28%)。当均值≤0.50mg/L时,系统间绝对偏差范围为-0.22mg/L～0.16mg/L；当均值>0.50mg/L时,系统间相对偏差范围为-34.1%～29.6%。用高值参考物质单独校准检测系统后,系统间相关性R2=0.82,有89%结果在可接受范围内,绝对偏差与相对偏差范围分别为-0.05mg/L～-0.29mg/L和-57.4%～23.5%。联合5个批号参考物质校准后,系统间相关性R2=0.90,89%结果在可接受范围内。绝对偏差与相对偏差范围分别为-0.10mg/L～O.12mg/L和-46.6%～36.8%。结论：1.FⅧ和FⅨ活性检测参考物质的均匀性和稳定性良好,在3种主流检测系统间具有互通性,定值结果准确可靠。2. ①STA-R Evolution血凝仪FⅧ和FⅨ活性检测性能符合厂家及相关文件的要求,性能验证方案可为其它检测系统的性能验证提供参考。②参考物质可应用于FⅧ和FⅨ活性检测日常室内质量控制。③对于Stago STA-R Evolution和Sysmex CS5100两系统,分别比对FⅧ活性检测结果范围为1.3%～123.1%的40份临床标本和FⅨ活性检测结果范围为3.4%-147.6%的37份临床标本,FⅧ和FⅨ活性检测结果相关性好(R2≥095),可比性可接受(至少80%结果在允许范围内)。使用LOT4、高值参考物质单独校准和4个批号参考物质联合校准后,FⅧ和FⅨ活性检测相关性无明显变化,可比性均提高。3.D-二聚体检测参考物质,其均匀性和稳定性良好,在3种主流检测系统间具有互通性,定值结果准确可靠。4. ①STA-R Evolution血凝仪的D-二聚体定量检测性能验证结果符合厂家及国家指南要求,性能验证方案可为其它检测系统的性能验证提供参考。②参考物质可用于D-二聚体检测日常室内质量控制。③基于本次研究结果显示,对于Stago STA-R Evoltuion和Sysmex CA1500两系统,比对D-二聚体检测结果范围为0.18mg/L～3.69mg/L的38份临床标本,其结果相关性好(R2≥095),可比性可接受(至少80%结果在允许范围内),用高值单独校准和5个批号参考物质联合校准后,两系统间相关性和可比性无明显改善。