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Myostatin(MSTN)是一种肌肉生长负调控因子,这种因子主要在动物骨骼肌中表达。Myostatin前肽(Myostatin propeptide, MSTN pro)可以与其结合,使其失去生物学功能,从而促进肌肉生长。EB肽和CV-N蛋白是具有广谱抗病毒作用的抗病毒肽。本试验旨在构建猪Myostatin前肽与抗病毒肽融合基因的表达载体,研发促生长抗病毒的基因工程药物,具有重要的科学和实践意义。从本实验室已经构建好的pEASY-T3-MSTN载体上扩增了猪Myostatin前肽的基因序列,并亚克隆至pcDNA3.1(+)载体上,命名为pcDNA3.1(+)-MSTN pro。为构建融合表达载体,设计引物时加入Linker序列,以PEASY-T3-MSTN为模板,扩增了含有linker的目的基因,并亚克隆至pcDNA3.1(+)载体上,命名为pcDNA3.1(+)-MSTN pro-L。根据EB肽的氨基酸序列,用DNAman推出EB肽的基因序列,送至公司合成,然后克隆至pcDNA3.1(+)-MSTN pro-L载体上,命名为pcDNA3.1(+)-MSTN pro-L-EB。根据NCBI GenBanK登陆的蓝藻抗病毒蛋白N基因序列(登录号为DQ668406.1),送至公司合成,然后克隆至pcDNA3.1(+)-MSTN pro-L载体上,命名为pcDNA3.1(+)-MSTN pro-L-CV-N。电泳和测序结果表明成功构建了真核表达载体。将构建好的载体pcDNA3.1(+)-MSTN pro、pcDNA3.1(+)-MSTN pro-L-EB、 pcDNA3.1(+)-MSTN pro-L-CV-N以及pcDNA3.1(+)质粒,转染C2C12成肌细胞,分别将其设为MSTN pro组、MSTN pro-L-EB组、MSTN pro-L-CV-N组和pcDNA3.1(+)组,同时设立一个未转染载体组,以此方式进行了以下三个实验：(1)载体表达效果检测试验：转染48小时后,通过实时荧光定量PCR检测MSTNpro及其与EB或CV-N融合基因的mRNA表达,结果显示,与未转染载体组和pcDNA3.1(+)组相比,MSTN pro组的MSTN pro基因mRNA表达极显著升高；与未转染载体组相比,MSTN pro-L-EB组的MSTN pro-L-EB基因mRNA表达显著升高,MSTN pro-L-CV-N组的MSTN pro-L-CV-N基因mRNA表达极显著升高。以上结果表明成功实现三个载体的转染和表达。(2)细胞增殖检测试验：转染48小时后,通过显微镜下细胞计数检测各转染组对C2C12细胞增殖的影响,结果显示,与未转染载体组相比,其他四组细胞的增殖量都明显减少；与pcDNA3.1(+)组相比,MSTN pro组、MSTN pro-L-EB组和MSTN pro-L-CV-N组的细胞增殖量增加,其中MSTN pro组增殖量增加显著。(3)抗病毒检测试验：转染48小时后,在每组加入猪瘟或猪繁殖与呼吸综合征病毒,4小时后通过AnnexinV/PI双染法检测各组的细胞凋亡情况,结果表明,同一条件下,EB肽对两种病毒都有一定的抗病毒作用,而蓝藻抗病毒蛋白N仅对猪瘟病毒有一定的抗病毒作用,而且比EB肽要强。