目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其致死率居高不下。目前针对肺癌的治疗方法主要包括外科治疗，化学治疗和放射治疗。但化疗一般难以达到治愈非小细胞肺癌的效果。而放射治疗过程中往往会发生放疗抵抗现象，成为限制放疗效果的关键因素。因此寻找和鉴定肺癌的分子标记物，对于早期诊断、治疗以及判断肺癌的预后情况十分重要。TRIM(tripartite-motif protein)蛋白家族成员通常具备E3泛素连接酶活性，在细胞的各项生理过程中发挥多样性的生物学功能。越来越多的研究表明TRIM家族蛋白在生物体发展过程中独有的非常重要的作用，该家族蛋白的异常表达可能诱发多种类型的疾病，包括发育障碍，免疫系统疾病甚至是恶性肿瘤。TGF-β是生物体内一种拥有多种功能的活性细胞因子。Smad蛋白是细胞内重要的TGF-β信号转导和调节因子。TGF-β/Smad信号转导通路的异常与包括肿瘤在内的多种疾病的发生和发展密切相关。最近有研究显示，骨肉瘤组织中TRIM66的表达水平显著高于正常组织，并且TRIM66过表达与患者较高的局部复发率，淋巴结转移以及较短的生存期密切相关。在骨肉瘤细胞中沉默TRIM66能够明显抑制TGF-β/Smad信号通路，提示TRIM66可能通过TGF-β/Smad调节肿瘤细胞侵袭。然而，在非小细胞肺癌中，TRIM66是否通过TGF-β/Smad信号通路影响细胞的恶性行为以及具体的作用机制目前尚不清楚。本研究的目的是探索TRIM66促进肺癌增殖与侵袭以及介导化疗耐药的相关机制，同时揭示TRIM66通过TGF-β/Smad/EMT信号通路调控非小细胞肺癌的恶性生物学行为。　　研究方法:1、样本来源:本次研究获得了中国医科大学附属第一医院伦理委员会的批准。非小细胞肺癌组织以及相应癌旁正常组织取自于在该医院确诊为非小细胞肺癌并且进行手术切除的患者。临床和组织病理学的数据，包括组织病理学诊断以及肿瘤分级均取自患者的医疗记录。患者在术前未经过化疗和放疗。2、免疫组织化学:肿瘤组织样本用10％中性福尔马林进行固定并用石蜡进行包埋，制备4μ m厚度的样本。样本用二甲苯进行脱蜡，然后用浓度梯度的酒精进行再水化。接着使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复。使用双氧水进行内源性过氧化物酶的阻断。使用山羊血清减少非特异性连接。进行一抗孵育，使用的抗体为TRIM66(mouse monoclonal antibody，1∶200 dilution)，孵育条件为4℃，过夜。鼠免疫球蛋白作为阴性对照。接着进行二抗孵育及DAB显色，复染使用苏木精染色液，封片前用浓度梯度酒精进行脱水。两位病理专家对所有样本进行随机检测，每个样本随机选取5个视野，每个视野在放大400倍条件下均可观察到100个细胞。TRIM66的免疫组织化学染色采用半定量法进行估测，包括肿瘤区域强度以及肿瘤细胞的百分比。TRIM66染色强度分为0(negative)，1(weak)，2(moderate)，3(strong)。按肿瘤细胞染色百分比分为1(1-25％)，2(26-50％)，3(51-75％)，4(76-100％)。样本的最后评分为染色强度与肿瘤细胞百分比得分的乘积，范围在0-12之间。评分小于6为TRIM66低表达，大于等于6为TRIM66高表达。3、细胞培养与转染:肺癌细胞系A549，H1299购买于美国典型培养物保藏中心。细胞培养用含10％胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基。培养条件为37℃，CO2浓度为5％。细胞接种密度都为1∶2，生长2-3d即可传代一次。TRIM66质粒购自origene公司，TRIM66干扰购自Dharmacon公司。将细胞采用常规方法进行适当消化，均匀接种于6孔培养板中，继续培养，待细胞生长成为单层70％密度时进行转染。先用无血清培养基培养2小时对细胞进行饥饿处理。用Lipofectamine2000进行转染。转染步骤按照转染试剂说明进行。转染48小时收集细胞进行后续实验。4、Western blot:细胞总蛋白的提取用RIPA裂解液，定量方法参照Bradford法。蛋白样品转印于PVDF膜上，并进行一抗孵育。一抗使用的抗体为TRIM66(1∶1000)，p-Smad2(1∶1000), snail(1∶1000), slug(1∶1000), E-cadherin(1∶1000), N-cadherin(1∶1000),ZO-1(1∶1000)，GAPDH(1∶2000)，抗体孵育的条件为4 ℃，过夜。二抗孵育所用抗体为过氧化物酶耦合的山羊抗兔/鼠抗体(1∶2000)，孵育条件为37℃，两小时。本实验用.ECL发光液进行发光，使用DNR Imaging System进行曝光。5、集落形成实验:细胞经过转染或者干扰后48小时，收集细胞并接种于直径为6cm细胞培养皿，接种密度约为1000个/皿。细胞连续培养7周，用PBS缓冲液漂洗细胞表面，并用吉萨姆染色液进行染色。在光学显微镜下进行观察，超过50个细胞的集落即可进行计数。6、MTT实验:细胞经过转染或者干扰后24小时，收集细胞并接种于96孔培养板中，接种密度约为每孔3000个细胞，连续培养5天。检测细胞活力时，每孔加入20μl5 mg/ml MTT溶液，并继续在37℃条件下培养4小时。将培养基去除，每孔加入150μl DMSO。用酶标仪进行检测，检测波长为490nm。7、流式细胞术:细胞的凋亡水平通过AnnexinⅤ/PI双染实验进行分析，所用仪器为FACS Calibur流式细胞分析仪。细胞的周期变化情况通过PI单染实验进行分析，所用仪器为FACS Calibur流式细胞分析仪。8、基质胶侵袭实验:细胞侵袭实验用24孔Transwell小室，每个小室用20μ l基质胶进行包被（基质胶稀释比例为1∶3）。细胞转染后48小时，用胰蛋白酶进行消化，并用无血清RPMI-1640培养基进行稀释。将稀释后的细胞悬液加入到transwell上室中，下室加入含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃条件下培养16小时。将未闯过基质胶的细胞用棉签轻轻擦去，将穿过基质胶的细胞用4％多聚甲醛进行固定，用苏木精进行染色。随机选取5个视野并在显微镜下进行计数。本实验重复三次。9、统计分析:统计分析所用软件为SPSS16.0。分析TRIM66表达水平与临床病理因素之间的相关性用卡方检验法。分析胃癌患者的生存概率用Kaplan-Meier检验法。分析不同组别患者生存率的差异采用Mantel slog-rank检验法。Cox回归模型应用于多变量分析。实验组与对照组之间的差异采用Students t检验法。p＜0.05表示具有显著差异。　　结果:1、TRIM66在非小细胞肺癌中的表达及临床意义。通过免疫组织化学方法检测了非小细胞肺癌以及相应癌旁正常组织中TRIM66的表达水平，发现TRIM66在非小细胞肺癌组织中表达量显著增加，而在癌旁正常组织中表达量较低。进一步分析TRIM66表达水平与临床病理因素之间的相关性发现，TRIM66高表达与肿瘤恶性分化程度正相关(p=0.0283)。另外，TRIM66高表达与肺癌患者的p-TNM分期(p=0.0002)和淋巴结转移(p=0.0133)有着显著关系。进一步分析TRIM66与生存时间的关系，我们发现TRIM66高表达患者生存时间明显小于TRIM66低表达的患者的生存时间(p＜0.05)。COX多因素分析发现TRIM66高表达与淋巴结转移是肺癌独立的预后因素。2、TRIM66促进非小细胞肺癌增殖、侵袭，并增加肿瘤细胞的耐药性。我们将TRIM66质粒和siRNA分别转染于A549，H1299两株肺癌细胞系，并将处理后的细胞进行MTT实验，集落形成实验，细胞周期分析实验，基质胶侵袭实验以分析TRIM66对细胞增殖，周期，侵袭产生的影响。MTT实验结果表明转染TRIM66后肺癌细胞的增殖能力升高，而TRIM66特异性siRNA干扰明显降低了肺癌细胞的增殖能力。集落形成实验取得了相似的结果，TRIM66转染后肺癌细胞形成的集落数目增加，而TRIM66特异性siRNA干扰明显降低肺癌细胞形成的集落数目。Transwell实验结果表明:TRIM66干扰后细胞的侵袭能力受到抑制而TRIM66质粒转染则促进了细胞的侵袭能力。将经过TRIM66转染以及干扰的肺癌细胞用顺铂进行处理，并通过流式细胞术分析其凋亡水平变化，结果表明:与对照组相比，转染TRIM66质粒后，由顺铂诱导的凋亡率明显降低;而干扰TRIM66后，由顺铂诱导的凋亡率明显增加。3、TRIM66通过TGF-β/Smad2/EMT级联信号通路调控非小细胞肺癌的恶性生物学行为。我们通过Western blot以及免疫荧光方法检测与细胞增殖，侵袭相关蛋白的表达水平，发现转染TRIM66后，肺癌细胞中p-Smad2，snail，slug，N-cadherin表达量上调，E-cadherin和ZO-1表达量下调。相反干扰TRIM66后，肺癌细胞中p-Smad2，snail，slug，N-cadherin表达量下调，E-cadherin和ZO-1表达量上调。另外，我们研究发现TRIM66能够调节Smad2的磷酸化水平（图3）。TRIM66表达增加，p-Smad2升高;TRIM66表达下降，p-Smad2表达降低。接下来，我们应用TGF-β抑制剂来验证TRIM66促进肺癌细胞发生EMT是否依赖于TGF-β/smad通路。在沉默了TRIM66的H1299细胞中加入TGF-β抑制剂SB431542，浓度为10μM，作用时间为10小时，结果显示，抑制TGF-β/smad通路能够减弱TRIM66引起的EMT改变，提示TRIM66可能依赖TGF-β/smad通路促进肺癌细胞中的上皮间质转化。　　结论:本研究证实了TRIM66在非小细胞肺癌中表达增加并与肿瘤较高的TNM分期，淋巴结转移以及患者的不良预后情况显著正相关。此外，还证实了TRIM66作为原癌基因在肺癌细胞系中促进细胞增殖，侵袭并介导肺癌细胞耐药。重要的是，我们发现TRIM66通过TGF-β/Smad2/EMT级联信号通路实现对肺癌细胞恶性进展的调控。