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淫羊藿(Epimedium davidii Franch)为我国传统的补益中草药,具有"益精气,坚筋骨,补腰膝,强心力"之功效。随着近年来对其药理学功能的研究日益深入,我们发现淫羊藿总黄酮(Epimedium flavones,EF)为淫羊藿的主要药理有效成分。诸多临床和实验研究表明,其具有抗病毒、抗氧化、免疫增强等效果。然而,由于黄酮类水溶性较差,在实际临床应用时经常会造成一定的不便。为此,本研究着眼于提高地淫羊藿总黄酮的生物利用率,更好地发挥其抗病毒效果,为其在临床推广应用服务。本研究采用磷酸化分子修饰,通过正交试验得到最优修饰条件,将磷酸根取代其本身的羟基,形成磷酸化淫羊藿黄酮(phosphated Epimedium flavones,pEF),探究EF、pEF在体外鸭胚肝细胞(duck embryonic hepatocytes,DEHs)上抗 1 型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus 1,DHV-1)活性、体外抗病毒机制、淋巴细胞增殖和体内增强免疫功能、抗氧化能力的效果并通过干预实验再次验证,旨在研究一种新型抗病毒药物。本试验分为以下五个部分:试验Ⅰ淫羊藿总黄酮的磷酸化分子修饰及结构鉴定本试验旨在研究淫羊藿总黄酮磷酸化修饰的修饰条件及磷酸化修饰物的结构鉴定。首先采用三聚磷酸钠-三偏磷酸钠作为磷酸化试剂,按照L9(34)水平设计正交试验筛选最优修饰条件;然后采用FT-IR、HRESIMS、NMR对修饰后的磷酸化产物进行结构鉴定。试验结果表明,制备磷酸化淫羊藿总黄酮的最佳磷酸化条件为反应温度70℃、反应时间6 h、反应pH=9。经过FT-IR、HRESIMS、NMR比较修饰前与修饰后的结构,我们得出了磷酸化修饰7后淫羊藿苷的分子式为 6"’-磷酸化淫羊藿苷(8-prenylkaempferol-4’-methylether-3-rhamnosyl-7-(6"’-phosphate)-glycoside)。试验Ⅱ淫羊藿总黄酮及其磷酸化修饰产物体外抗鸭肝炎病毒研究本试验旨在研究淫羊藿总黄酮(EF)及磷酸化淫羊藿总黄酮(pEF)在体外抗鸭肝炎病毒(DHV-1)效果。比较了两者抗DHV-1感染鸭胚肝细胞(DEHs)的活性,并采用直接免疫荧光法和real-time PCR法比较两者对病毒吸附、复制、释放的影响。试验结果显示,EF与pEF均能显著提高侵染病毒后的DEHs细胞活性,pEF效果优于EF。两者均能抑制病毒复制及释放,pEF对病毒复制环节的抑制明显优于EF,二者对病毒吸附细胞有一定抑制作用,但二者间无显著差异。试验Ⅲ淫羊藿总黄酮及其磷酸化修饰产物治疗鸭病毒性肝炎及抗氧化损伤作用研究本试验研究了 EF和pEF对DVH的治疗作用和抗氧化损伤作用。180羽櫻桃谷鸭随机均分4组:EF组,pEF组,VC组,BC组。EF,pEF,VC组以DHV-1攻毒后,EF组和pEF组按31.25 mg/Kg·d.羽分别于饮水给药混饮,连续3 d;攻毒后4 h,8 h,54 h时每组随机抽取5羽采血,测定分析血中氧化损伤和肝损伤生化评价指标的变化及其间的相关性;每天定期观察鸭群临床症状及死亡情况。结果表明DHV-1感染可以造成雏鸭显著的氧化损伤及肝损伤,EF和pEF可以提高存活率,减轻感染鸭肝脏病理损伤,降低氧化应激损伤及肝损伤;同时发现DHV-1导致的氧化损伤与肝损伤有一定的相关性。试验Ⅳ淫羊藿总黄酮及其磷酸化修饰产物免疫增强作用研究本试验旨在研究EF和pEF对DHV-1感染雏鸭免疫功能的作用。首先在体外测定了 EF和pEF单独或协同PHA、LPS刺激T、B淋巴细胞增殖的效果,并观察了 EF和pEF对DHV-1感染雏鸭体内血液内病毒含量及血清抗体(Ab)、细胞因子(IFN-γ、HGF、IL-2、IL-6)水平,分析了免疫功能评价指标(Ab和细胞因子)与肝损伤评价生化指标(ALT、AST、ALP、LDH)的相关性。结果发现EF与pEF可以单独或协同LPS和PHA提高T、B淋巴细胞增殖率,提高鸭血清Ab、IFN-y,IL-2,IL6和HGF水平,同时免疫指标与肝损伤指标间的强相关性表明EF与pEF的免疫增强作用在抗DVH过程中发挥着重要影响。试验Ⅴ用氧化应激和免疫损伤干预试验验证淫羊藿总黄酮及其磷酸化修饰产物治疗DVH的作用途径本试验拟采用人工干预的方法对前述试验中发现的抗氧化和免疫调节机制在EF和pEF抗DVH中的作用予以验证。以扁柏酚(Hinokitiol)和他克莫司(FK506)分别作为促氧化剂及免疫抑制剂,观察干预前后DHV-1染毒鸭的动态死亡、氧化损伤(GSH-Px、MDA、SOD、catalase)及免疫功能(IL-2、IFN-1)评价指标的变化。结果显示EF与pEF抑制了扁柏酚和他克莫司的促氧化和免疫抑制作用,提高了扁柏酚和他克莫司干预后染毒鸭的存活率,说明了抗氧化和免疫调节对于EF和pEF治疗DVH均起到了重要作用。