论文部分内容阅读
目的:合成WSC-DTPA聚合物,并将其制备成纳米粒,体外研究其细胞摄取效果和辐射防护效果,为研制新型促排药物提供理论和实验依据。方法:通过N-乙酰化反应合成WSC-DTPA聚合物,离子凝胶法将其制备成WSC-DTPA纳米粒,对其结构及形态进行表征;利用FITC与WSC-DTPA纳米粒残余的氨基反应,制得FITC-WSC-DTPA纳米粒荧光探针,活细胞工作站(LCS)观察BRL细胞摄取FITC-WSC-DTPA纳米荧光探针的情况;采用MTT法检测不同浓度WSC-DTPA纳米粒对6Gy60Coγ射线照射后48h大鼠正常肝细胞(BRL)存活率的影响;流式细胞仪PI单染法检测BRL细胞经不同浓度WSC-DTPA纳米粒及6Gy60Coγ射线联合作用后细胞周期分布的变化;流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡双染法、Flou-3AM法、JC-1及荧光探针法分别检测不同浓度WSC-DTPA纳米粒对6Gy60Coγ射线照射后BRL细胞凋亡、胞内钙离子荧光强度、线粒体膜电位及活性氧的影响;克隆形成实验分析不同浓度WSC-DTPA纳米粒联合不同照射剂量对BRL细胞生存率的影响,以多靶单击数学模型S=1-(1-e-D/D0)n拟合细胞存活曲线,计算D0、Dq值及保护系数PF值,并评价其辐射防护效果。结果:TNBS法、傅里叶变换红外光谱及核磁共振氢谱均证实,通过N-乙酰化反应成功合成了游离氨基含量分别为92.7%、74.3%、14.1%、1.59%的WSC-DTPA聚合物。通过离子凝胶法制得的WSC纳米粒及游离氨基含量分别为92.7%、74.3%和1.59%的WSC-DTPA纳米粒,纳米激光粒度仪测量其平均粒度分别为7.31nm、8.42nm、8.34nm及14.53nm,且各个粒径测量值的PDI均小于0.03,透射电镜和扫描电镜观察其形态近似球形,大小均一。活细胞工作站检测表明,2h内WSC纳米粒及WSC-DTPA纳米粒能通过细胞膜,进入细胞,而非纳米化的WSC和WSC-DTPA聚合物则未进入细胞。MTT法结果表明,在1.5650.0μg/mL浓度范围内WSC-DTPA纳米粒对BRL细胞无毒性,与照射组(6Gy-0μg/mL)相比,1.59%WSC-DTPA纳米粒加药组及浓度在6.25μg/mL以下的92.7%WSC-DTPA纳米粒加药组,对6Gy60Coγ射线照射后BRL细胞存活率无明显差异,而WSC、WSC纳米粒及浓度在6.25μg/mL以上的92.7%WSC-DTPA纳米粒使BRL细胞存活率明显提高(p<0.05)。流式细胞仪PI单染法结果表明,与照射组(6Gy-0μg/mL)相比,WSC加药组、WSC纳米粒加药组及浓度在6.25μg/mL以上的92.7%WSC-DTPA纳米粒加药组,使6Gy60Coγ射线照射后BRL细胞的SubG1峰显著降低(p<0.05),而1.59%WSC-DTPA纳米粒加药组及浓度在6.25μg/mL以下的92.7%WSC-DTPA纳米粒加药组,BRL细胞的SubG1峰没有明显变化。流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡、Flou-3AM检测胞内钙离子荧光强度的变化、JC-1检测线粒体膜电位及荧光探针检测活性氧结果表明,与照射组(6Gy-0μg/mL)相比,1.59%WSC-DTPA纳米粒加药组及浓度在6.25μg/mL以下的92.7%WSC-DTPA纳米粒加药组,BRL细胞凋亡率、胞内钙离子荧光强度、线粒体膜电位及活性氧没有明显变化,而WSC加药组、WSC纳米粒加药组及浓度在6.25μg/mL以上的92.7%WSC-DTPA纳米粒加药组细胞凋亡率明显降低,胞内钙离子荧光强度显著降低,线粒体膜电位明显升高,活性氧显著降低(p<0.05);且细胞内钙离子荧光强度与细胞凋亡率呈良好线性正相关,经统计分析,R2在0.96030.9940之间,p均小于0.05,说明线性拟合度较高。克隆形成实验结果表明,1.59%WSC-DTPA纳米粒加药组及浓度在6.25μg/mL以下的92.7%WSC-DTPA纳米粒加药组的PF值均小于1,而WSC加药组、WSC纳米粒加药组及浓度在6.25μg/mL以上的92.7%WSC-DTPA纳米粒加药组的PF值均大于1。以上细胞实验结果基本一致,即WSC、WSC纳米粒及浓度在6.25μg/mL以上的92.7%WSC-DTPA纳米粒对6Gy60Coγ射线照射后BRL细胞具有辐射防护作用,而1.59%WSC-DTPA纳米粒及浓度在6.25μg/mL以下的92.7%WSC-DTPA纳米粒对其无辐射防护作用。结论:本研究通过N-乙酰化反应和离子凝胶法成功地制备出游离氨基含量分别为92.7%、74.3%、1.59%的WSC-DTPA纳米粒,采用活细胞工作站观察到2h内纳米粒可以透过细胞膜进入细胞,通过细胞实验证明了浓度在6.25μg/mL以上的92.7%WSC-DTPA纳米粒对6Gy60Coγ射线照射的BRL细胞具有一定的辐射防护作用,而为下一步研究WSC-DTPA纳米粒的体内促排及防护作用奠定基础。