论文部分内容阅读
奶牛乳腺炎（mastitis）是指奶牛乳腺受到物理和化学因素的刺激,尤其是微生物入侵引起的炎症变化。奶牛乳腺炎一方面导致产奶量和乳制品质量的下降,给养殖场造成经济损失,另一方面在治疗过程中广泛使用抗生素等,又带来乳汁中抗生素等兽残问题。近年来的研究显示,microRNA（miRNA）在固有性免疫应答、病原体感染与免疫、以及炎症免疫调控中扮演着十分重要的作用。miRNA通过结合与其种子序列互补配对的靶基因上,引起靶mRNA降解或抑制靶mRNA的翻译,从而在转录后水平调控基因的表达。本研究,基于前期的高通量测序和转录组学分析,在健康和患乳腺炎奶牛乳腺组织中miR-145存在差异表达,因此,选择miR-145为本试验的研究对象。研究了miR-145在乳腺炎发病过程中的功能以及miR-145靶向调控PXN的分子机制。主要研究内容如下:1.miR-145的生物信息学分析通过MEGA7.0软件,对不同物种miR-145基因进行序列比对和构建进化树;利用RT-qPCR技术,分析miR-145在健康/患乳腺炎奶牛乳腺组织的差异表达;运用Mirdb、Targetscan、Pictar三种生物学软件预测靶基因,并进行GO/KEGG分析;利用TFBIND预测miR-145的转录因子;并结合BioGRID3.4、STRING等蛋白互作数据库,利用cytoscape构建TF-miRNA-靶基因调控网络图。结果表明,miR-145在进化上具有高度的保守性;miR-145在患乳腺炎母牛乳腺组织中表达量显著低于健康母牛（P<0.05）;三个软件预测的靶基因交集有90个,GO富集分析显示,注释的靶基因主要参与RNA聚合酶II启动子的转录负调控、转化生长因子β受体信号通路和细胞增殖负调控等生物学过程。KEGG Pathway分析表明,靶基因主要参与上皮细胞的细菌侵入、MAPK信号转导通路和Rap1信号通路;成功构建TFs-miR-145-靶基因调控网络,并挖掘出关键的转录因子、靶基因和调控反馈回路。2.LTA诱导型奶牛乳腺炎上皮细胞模型构建用LTA对奶牛乳腺上皮细胞进行炎症诱导,结合ELISA和RT-qPCR试验,获得LTA诱导炎症的最佳时间和浓度。结果显示20ng/μL LTA处理奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）12h可使IL-6、TNF-α炎症因子表达水平达到最大值,完成了LTA诱导型奶牛乳腺炎上皮细胞模型的建立。3.miR-145靶向调控PXN分子机制研究首先,利用生物信息学预测软件发现miR-145与PXN基因存在靶向调控关系。将构建的PMIR-PXN-3’UTR的双荧光素酶报告载体以及PEZX-miR-145瞬时共转染293T细胞。结果显示:与对照组相比,miR-145+PXN组双荧光素酶活性显著低于对照组（P<0.01）。然后,在MAC-T细胞中分别转染miR-145 mimic、miR-145 inhibitor和NC,通过RT-qPCR和Western blot试验检测了PXN在mRNA和蛋白水平的表达量。结果显示:与对照组相比,miR-145mimic组能显著抑制PXN在mRNA和蛋白水平的表达量（P<0.001;P<0.05）,而miR-145 inhibitor组结果相反（P<0.001;P<0.05）。因此,可确定miR-145能靶向调控PXN的表达。4.炎症条件下miR-145在奶牛MAC-T中的功能研究为探究miR-145在炎症条件下MAC-T中的功能,基于构建的炎症模型,分别转染了miR-145 mimic、miR-145 inhibitor和NC对照,并通过ELISA和RT-qPCR检测了白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）两种炎性因子的水平变化,利用RTCA和流式细胞术检测了MAC-T细胞的增殖变化,通过激光共聚焦试验检测了MAC-T细胞微丝的变化。结果显示:与对照组相比,转染miR-145 mimic后能够显著降低IL-6和TNF-α细胞因子的表达量（P<0.01;P<0.01）,促进了MAC-T细胞的增值,并抑制了细胞微丝的解聚。转染miR-145 inhibitor结果正好相反。综上所述,研究表明miR-145可通过靶向调控PXN的表达,影响炎性条件下奶牛乳腺上皮细胞的表型变化,进而参与奶牛乳腺炎的发病过程。