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猪体外受精(In vitro fertilization,IVF)过程中容易发生多精入卵现象,导致猪胚胎发育率和产子率降低。有研究表明泛素蛋白酶体途径(Ubiquitin ProteasomePathway,UPP)在海鞘类和哺乳类IVF过程中具有重要的作用,在精卵结合时能够降解透明带(Zonapellucida,ZP)蛋白,帮助精子穿透ZP,从而成功受精。UPP是生物体内主要的蛋白质降解途径,依赖ATP提供能量,具有调节内环境稳态和降解错误折叠与多余蛋白的作用,与人类的基因遗传疾病、癌症、肿瘤、神经疾病等多种疾病有关。其主要的执行过程被称为Ub降解途径,受泛素激活酶(Ubiquitin activating Enzyme,E1)、E2酶、E3酶和去泛素化(deubiquitination,DUBs)酶调控,也有研究表明UPP途径对精子发生和卵母细胞发生也具有十分重要的作用,但是到目前为止,在猪IVF的两个配子形成过程中Ub蛋白的来源及精卵结合过程中Ub的作用尚不十分明确。因此,本试验中研究了成熟精子、成熟精子对应的精清、未成熟精子和未成熟精子对应的精清中Ub蛋白含量,不同直径卵泡液中Ub蛋白含量及卵母细胞成熟情况,并在卵母细胞培养液与IVF液中添加ATP循环产物无机磷酸盐(Inorganic phosphate,PPi)、E2和DUBs抑制剂,检测其对精子获能、顶体反应(acrosome reaction,AR)的Ub程度的影响,和对卵母细胞成熟率、Ub程度及多精入卵的影响。检测不同时期的黄体与卵丘颗粒细胞中的Ub蛋白含量,并在猪精子保存液中添加PPi检测其对精子生物学指标及与泛素相关的蛋白的影响。结果表明:(1)在猪精子保存液中添加浓度为50 μM的PPi能够在保存过程中显著地提高精子的生物学指标及Ub、顶体酶抑制剂(acrosin inhibitor,AI)、PSMD4蛋白的含量(P<0.05);(2)成熟精子中的Ub蛋白含量显著地高于未成熟精子和成熟精子对应的精清(P<0.05),未成熟精子对应的精清中不含Ub蛋白,直径为3-6 mm的卵泡的卵泡液中Ub含量显著地高于直径为1～3和6 mm以上组(P<0.05),中期黄体中Ub蛋白含量显著地高于早期和晚期黄体(P<0.05),卵丘细胞中含有Ub蛋白;(3)在猪精子获能液中分别添加不同浓度的E2和DUBs抑制剂,分别当浓度达到10μM时能够显著地降低Ub蛋白、AI蛋白和PSMD4蛋白的含量(P<0.05);(4)不同直径卵泡液中的卵母细胞成熟后,有3条明显的条带,且直径是3～6 mm的卵泡中卵母细胞成熟率与Ub水平显著地高于其他两组(P<0.05),在猪卵母细胞IVM液中分别添加不同浓度的PPi、E2和DUBs抑制剂,浓度为1 μg/mL的PPi能够显著地提高卵母细胞的成熟率(P<0.05),但是其Ub蛋白含量显著地低于对照组和其他处理组,添加10 μM的E2抑制剂能够显著地降低卵母细胞成熟率和Ub蛋白含量(P<0.05),且随着浓度增加卵母细胞成熟率与Ub蛋白含量逐渐降低,添加10 μM的DUBs抑制剂能够显著地降低卵母细胞成熟率和Ub蛋白含量(P<0.05),且随着浓度增加卵母细胞成熟率与Ub蛋白含量逐渐降低;(5)在猪IVF液中添加不同浓度的PPi、E2和DUBs抑制剂,浓度为1 μg/mL的PPi能够显著地增加ZP硬化时间(P<0.05),显著地降低精子多精入卵率(P<0.05),添加浓度为10 μM的E2抑制剂能够显著地增加ZP硬化时间(P<0.05),显著地降低精子多精入卵率(P<0.05),添加浓度为10μM的DUBs抑制剂能够显著地增加ZP硬化时间(P<0.05),显著地降低精子多精入卵率(P<0.05)。因此,添加浓度为50 μM的PPi在精子保存液中能够显著地提高精子的保存效率,浓度为10 μM的E2和DUBs抑制剂能够显著地降低精子获能和AR后的Ub和AI蛋白含量,浓度为1μg/mL的PPi能够显著地增加卵母细胞成熟率、显著地降低Ub蛋白含量及多精入卵率,浓度为10 μM的E2和DUBs抑制剂能够显著地降低卵母细胞成熟率、显著地降低Ub蛋白含量及多精入卵率。同时也说明UPP在精子发生、卵母细胞成熟和体外受精过程、精卵结合中都具有十分重要的辅助作用,它是在精子成熟和卵母细胞成熟时就形成的。