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冠心病心肌梗死的发病率越来越多,经皮冠脉介入(PCI)和溶栓治疗使冠脉血管尽早再通以达到防治心肌梗死范围进一步扩大,已经成为临床广泛应用的治疗手段;但恢复缺血心肌组织的血流灌注本身可以加重心肌的进一步损伤,即缺血/再灌注损伤。而目前对于缺血、缺血/再灌注损伤的心肌保护,仍缺乏确实可行而又直接的临床治疗手段。日益增多的研究发现,缺血预适应是机体产生的一种强大的内源性心肌缺血、缺血/再灌注损伤的自我保护机制,最早发现于心肌的缺血预适应是指短暂缺血/再灌注后能使组织细胞耐受随后长时间缺血损伤的现象。这一自我保护机制也发现存在于血管内皮细胞。血管内皮细胞位于血液和组织器官的关键界面,不仅是血液和组织之间的重要屏障,可以防治有害因素对内皮下实体组织细胞的侵袭,也是极其活跃的分泌组织,可以分泌多种生物活性物质以调节对组织的氧和营养物质供应,从而维持组织器官的正常功能。早期的研究证明,在缺血、缺血/再灌注损伤过程中,血管内皮细胞结构和功能的损害可以引起心肌细胞等实质细胞的损伤发生;血管内皮细胞的结构和功能异常早于心肌细胞的损伤,缺血缺氧导致内皮细胞凋亡先于心肌细胞凋亡的发生,而内皮细胞的结构和功能的恢复快于实质细胞。提示保护血管内皮细胞的健康完整有可能预防或减轻心肌细胞的缺血、缺血/再灌注损伤。因而,研究血管内皮细胞缺血、缺血/再灌注损伤的预适应保护,对保护心肌细胞的缺血损伤具有重要理论和临床意义。迄今为止,缺血预适应的机制仍未完全清楚。首先,缺血预适应涉及到十分复杂的作用机制。针对一个或数个基因的研究多有报道,但缺血预适应保护是机体对缺血、缺血/再灌注损伤的一种系统性保护反应,涉及到预适应这一系统中所有反应基因,这些反应基因的组合,最终共同决定了预适应保护效应。其次,缺氧诱导因子—1a(hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a)基因是介导缺氧反应基因转录活性的关键通道,在缺氧调节反应中起关键作用,通过增加HIF-1a基因表达,观察到对缺血、缺血/再灌注损伤的组织细胞具有保护作用。但沉默HIF-1a基因表达,从反面观察以证实HIF-1a基因在预适应保护中的作用尚鲜有报道。从这些思考出发,我们的研究拟对预适应保护的整体基因反应作一系统性观察,并沉默HIF-1a基因表达后,评估预适应保护效应,以作为预适应及其机制研究中的一个有益补充和完善。目的:通过建立体外人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells.HUVECs)缺氧预适应模型,模仿体内缺血预适应保护,系统检测缺氧预适应保护效应的基因表达改变,并进而研究HIF-1a基因在HUVECs缺氧预适应、缺氧/再氧化损伤中的作用,探讨缺氧预适应介导的HUVECs保护作用机理,为缺氧预适应保护的潜在临床应用打下基础并提供理论依据。方法:1、HUVECs培养并鉴定:经内皮细胞特异的Ⅷ因子相关抗原的单克隆抗体免疫荧光染色鉴定内皮细胞。2、缺氧预适应、缺氧/再氧化损伤模型建立:缺氧预适应由不同循环的预缺氧1h+再氧化1h组成,而缺氧/再氧化损伤由较长缺氧6h+再氧化1h组成。使用不同预缺氧/再氧化循环模拟体内缺血预适应,经检测MTT活性及LDH水平,以发现对缺氧/再氧化损伤保护的最适模型。3、缺氧预适应后HUVECs总RNA、蛋白样品的抽提:使用TRIzol试剂盒对预适应后的HUVECs总RNA以及蛋白质进行抽提、纯化、定量,并电泳及紫外分光光度法对质量进行鉴定,质量符合要求的样本用于进一步的研究。4、基因芯片检测缺氧预适应保护的基因表达:ArrayReady Oligo Set V2.0芯片(含人类21329个基因)对缺氧预适应保护进行基因表达检测,通过GenePixPro 5.1、Genesifter、Gene ontology等对基因芯片结果进行数据分析。荧光实时定量PCR对芯片结果进行可靠性验证。5、HIF-1a基因siRNA的准备:核苷酸序列为AAGGGTAAAGAACAAAACACA的HIF-1a基因特异性siRNA合成于Ambion公司,首先对其进行转染条件优化,发现最适转染浓度及基因沉默效应。6、用最适浓度siRNA转染经过或未经过缺氧预适应处理的HUVECs,通过毛细管实时荧光定量PCR、western blot方法检测HIF-1a表达沉默,通过LDH、Caspase-3测定以及Annexin V-Cy3标记免疫荧光凋亡检测,评价预适应保护效应及与HIF-1a基因的关系。7、统计学分析:结果以均数土标准差(Mean±SD)表示,采用统计软件SPSS 17.0进行One-Way ANOVA统计学分析。首先进行Levene方差齐性检验;对于方差齐性的进行方差分析及相应的LSD多重比较法分析;对于方差不齐的使用近似F检验Welch法及其相应的Dunnett’s 3多重比较方法分析;对于两独立样本均数比较采用两样本t检验分析。以α=0.05作为显著性的判断标准。结果:1、通过对培养基氧浓度的实时监测,对不同预缺氧/再氧化循环的筛选,发现经1～3次循环的缺氧预适应均具有保护HUVECs缺氧/再氧化损伤作用,但单次循环的预缺氧+再氧化作为预适应刺激,较多次循环的缺氧预适应有更好的保护作用。2、经基因芯片检测发现,预缺氧后的5个时间点共有不同的809个差异性表达基因,其表达改变(包括上调、下调)均超过常氧对照组2倍,且经ANOVA检测其P＜0.05。分组分析发现,预缺氧1小时(H1h组,即相当于预缺氧后再氧化0h)有460个差异表达基因,其中上调基因192个,下调基因268个;缺氧预适应后2小时(HPC2h组,即相当于预缺氧后再氧化3h)有406个,其中244个基因表达下调,上调基因162个;预适应后5小时(HPC5h组,即相当于预缺氧后再氧化6h)有322个基因,其中下调基因223个,上调基因98个;预适应后12小时(HPC12h组,即相当于预缺氧后再氧化13h)有350个基因,其中下调基因266个,上调基因84个;预适应后24小时(HPC24h组,即相当于预缺氧后再氧化25h)有183个基因,其中下调基因132个,上调基因51。在H1h、HPC2h、HPC5h、HPC12h、HPC24h点新增的差异表达数目分别为460、191、53、48、88个。综合分析,下调基因较上调的多。3、基因芯片结果的亚分析发现,下调或上调的差异表达基因或新增差异表达基因改变表现出三段式的改变,分别相对应于早期预适应保护期、中间无保护期及延迟预适应保护期,提示一种缺氧预适应保护的基因数改变与预适应保护的一致性变化。缺氧预适应诱导的差异表达基因除了12个基因从H1h点持续到HPC24h点外,大多数基因的差异表达持续时间较短。809个差异表达基因分属22种不同功能类别。表明缺氧预适应是多基因、多功能系统共同参与的复杂的生物调节过程。4、对差异表达基因中的7个基因进行实时荧光定量PCR测定,其结果与芯片检测结果的表达趋势高度相似,表明芯片检测结果的可靠性。5、初步分析发现12差异表达基因为以前已经证实的与缺氧预适应保护有关基因,包括损害性基因受抑制而下调,保护性基因受激活而上调。提示HUVECs缺氧预适应效应是保护性基因与损害性基因的动态平衡过程。且HUVECs缺氧预适应保护中存在着数量众多的全新差异表达基因,其在HPC中作用有待进一步深入研究。5、siRNA沉默HIF-1a基因表达后,缺氧/再氧化损伤导致HUVECs释放更多的LDH,表明血管内皮细胞的损伤加重,而Caspase-3的水平改变不显著,表明并不加重其凋亡。6、siRNA沉默HIF-1a基因表达后,缺氧预适应对HUVECs的缺氧/再氧化损伤仍有保护作用,但这种保护作用是不完全的、明显减弱的。从一个方面提示HUVECs的缺氧预适应保护与HIF-1a基因的表达具有明显联系。结论:1、成功建立了缺血预适应的HUVECs模型。2、缺氧/再氧化损伤对HUVECs具有显著的损害作用,而缺氧预适应可以显著减轻缺氧/再氧化损伤对HUVECs的损害作用。3、参与调节缺氧预适应HUVECs保护的基因多达809个,参与的功能系统多达23个。提示缺氧预适应是多基因、多功能系统共同参与的复杂的生物调节过程。4、已知的12个预适应保护有关基因表现为损害性基因受抑制而下调,保护性基因受激活而上调。提示HUVECs缺氧预适应效应是保护性基因与损害性基因的动态平衡过程。且HUVECs缺氧预适应保护中存在着数量众多的全新差异表达基因,其在HPC中作用有待进一步深入研究。5、HIF-1a基因抑制后,加重缺氧/再氧化损伤对HUVECs的损害作用,但并不加重其对HUVECs的诱导凋亡作用。6、HIF-1a基因参与缺氧预适应对HUVECs的保护效应,是缺氧预适应保护调节的重要因素。7、HUVECs的缺氧/再氧化损伤与HIF-1a基因的表达调节具有明显联系。