肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC)是一类人兽共患病病原菌,感染后可以引起人和动物的一系列临床症状。其中典型的肠外感染包括尿道、生殖道感染、中枢神经系统感染、循环系统和呼吸系统感染,并且感染数量逐年上升,增加了医疗成本,动物生产力下降,给社会带来了沉重的经济负担。细菌多重耐药性和生物被膜的形成,以及缺乏有效保护的疫苗,均使ExPEC的防控更加困难。在许多革兰氏阴性菌细胞膜中,均发现有多药抗性外排系统的存在,与临床细菌多重耐药性相关。多药抗性外排泵(Multidrug-resistance efflux pumps)由三组分构成：位于细胞膜内膜上的转运蛋白、位于周质间隙中的辅助蛋白、位于细胞膜外膜上的外膜蛋白,三者形成一个三聚体,由质子泵势能供能而发挥作用。耐大肠菌素TolC (Tolerant colicin)外膜蛋白是组成革兰氏阴性菌多药抗性外排泵的最重要的组成成分,参与许多不同家族外排泵的形成,介导多重耐药性的产生。近年来有研究表明TolC蛋白参与细菌的毒力和生物被膜的形成,并可参与细菌自身代谢产生的生物小分子和大分子物质的泵出。然而TolC在ExPEC中的生物学功能目前尚不清楚。本研究以猪源ExPEC PPECC42株为研究对象,通过构建tolC基因缺失株及其回复补偿株,系统探索外排泵蛋白TolC在ExPEC的生物被膜形成、致病性以及抵抗高渗环境中的作用,主要研究结果如下：1. TolC缺失对ExPEC生物被膜形成的影响以猪源ExPEC作为亲本株(WT),利用同源重组技术构建tolC基因缺失突变株(△tolC)及其回补株(Cm-to/C),并对其生物被膜形成能力进行评价。结果显示,在28℃培养条件下,在M9培养基中WT株和回补株均具有强生物被膜形成能力,而△tolC丧失了生物被膜形成能力。通过扫描电子显微镜对细菌表面结构进行观察发现,在M9培养基28℃条件下,WT菌株大量堆积、互相黏结作用、并且细菌表面具有大量的丝状菌毛样物质存在；而△tolC均以散在或单个存在在盖玻片上。curli菌毛和纤维素是大肠杆菌生物被膜形成过程中最为主要的两种胞外基质,通过刚果红染色法和荧光白染色法试验证实在M9培养基中28℃条件下,△tolC丧失了curli菌毛的生物合成能力,而纤维素合成能力增强。为进一步对△tolC的curli菌毛和纤维素的生物合成能力改变进行验证,采用qRT-PCR对curli菌毛合成基因csgB和csgD以及纤维素合成酶基因bcsA进行定量测定,结果显示在M9培养基28℃下,△tolC的csgB和csgD基因的表达量与WT株相比均显著下降(p<0.01),而bcsA基因的表达量在生物被膜形成后期显著升高(p<0.01)为探索TolC在ExPEC生物被膜形成以及胞外基质成分的生物合成中的作用与培养基渗透压之间的关系,本研究比较WT菌株和△tolC株在28℃下1/2 M9培养基中(一种低渗培养基)的生物被膜形成能力,结果发现△tolC的生物被膜形成能力得到恢复,并且为强生物被膜菌株,curli菌毛和纤维素的生物合成能力也恢复到WT菌株的水平,csgB/csgD和bcsA基因的表达在生物被膜形成中后期也恢复到WT菌株的水平。进一步研究表明,在1/2M9培养基中添加不同浓度的NaCl和蔗糖增加培养基渗透压后,WT菌株和△tolC株生物被膜形成能力均受到抑制；但与WT菌株相比,△tolC株的生物被膜形成能力对渗透压的变化更为敏感。此外,通过TRANS-WELL试验证实,△tolC株造成生物被膜形成能力差异过程中没有生物被膜形成相关信号小分子物质的参与；通过超薄切片和透射电子显微镜技术发现ΔtolC株与WT菌株相比,外膜结构的完整性发生改变。因此,TolC缺失导致ExPEC失去生物被膜形成能力,能使细菌外膜完整性发生改变,菌体表面正常的菌毛成分减少,降低了细菌对外界环境渗透压的适应能力。2. TolC缺失对ExPEC致病性的影响本研究采用体内和体外试验的方法评价tolC缺失对ExPEC毒力的影响。通过体内腹腔感染小鼠试验,结果表明△tolC株的毒力与WT菌株相比显著下降；补偿株的毒力得到恢复,证实tolC基因缺失可降低ExPEC的毒力和致病性。通过刚果红平板证实WT菌株可以形成curli菌毛,而tolC和csgD缺失菌株均不能生物合成curli菌毛。此外细菌对肺上皮细胞和巨噬细胞粘附侵袭实验表明,△tolC株对细胞的黏附和侵袭能力均显著下降,其中△tolC株的黏附和侵袭能力与csgD缺失株相当。在巨噬细胞存活试验中,与WT菌株相比在巨噬细胞中存活的早中期,△tolC株和△csgD株的存活能力相当,与WT菌株相比均显著下降。由于curli菌毛对细菌黏附和侵袭宿主细胞以及定植中发挥着重要作用,因此这些结果表明：△tolC株对细胞的黏附和侵袭能力的下降以及在巨噬细胞中存活能力的下降的原因是或部分是△tolC株curli菌毛合成能力丧失导致。对刚死亡的小鼠进行组织病理学观察发现,与WT菌株感染相比,感染△tolC株死亡的小鼠其大部分内脏器官的组织损伤程度均较小,组织中细菌团块也较少。因此,体外和体内试验均证实TolC参与了ExPEC的致病性,并且△tolC株的致病性下降可能是由于curli菌毛生物合成能力的丧失引起。此外,还通过2D电泳和质谱技术对WT菌株和tolC缺失菌株的膜蛋白质组学进行比较,分析tolC缺失对膜蛋白成分表达的影响,结果表明细菌膜蛋白中具有的差异蛋白分别为代谢酶类、调控蛋白以及毒力相关蛋白。根据上述研究结果,推测△tolC株对小鼠致病力下降可能是其在机体内定植和繁殖能力下降所致,导致这种下降作用可能是由于△tolC株的curli菌毛生物合成能力丧失以及引起细菌膜蛋白差异表达造成。3. TolC缺失对ExPEC在高渗环境下存活能力的影响本部分研究表明在含不同浓度的NaCl或蔗糖的M9培养基中培养时,与WT菌株相比,△tolC株在不同高渗培养基中的生长受到显著性的抑制,在培养24h后△tolC株与野生株相比,活菌数显著降低(P<0.05或P<0.01)。此外,在高渗的NaCl或蔗糖溶液中,△tolC株活菌数也同样显著下降(P<0.05或P<0.01),并且这种下降呈时间依赖性。因此表明ExPEC的△tolC株在NaCl或蔗糖形成的高渗溶液中,其生长作用或存活能力显著下降,证实TolC蛋白在ExPEC抵抗高渗环境中发挥着最基本的作用。由于外排泵蛋白TolC能够降低ExPEC在高渗环境中的存活能力,因此这种现象在食品工业中是非常有意义和价值的。为更进一步的研究外排泵抑制剂(efflux pumps inhibitors, EPIs)在高渗条件下对ExPEC存活的影响,在外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)联合高渗环境下测定ExPEC WT菌株的存活能力。当培养基或溶液中添加12.5 μg/ml CCCP后,WT菌株在不同的高渗溶液中与不加CCCP的相比,其存活能力显著下降。此外,添加CCCP后还可以抑制ExPEC的生物被膜形成,说明CCCP对于ExPEC生物被膜的形成具有有效的清除作用。由于EPIs可以加强高渗环境下对细菌的杀灭和抑制作用以及抑制生物被膜的形成,因此,EPI在食品工业中可能会成为一种有效的、非常具有潜力的食品添加剂成分。