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丙型肝炎是全世界流行的传染病。据世界卫生组织(World HealthOrganization，WHO)报道，全球流行率约3%。我国流行率为3.2%，感染者约为4000万。丙型肝炎易于慢性化，病情隐匿性进展，至出现临床症状时，常已出现了肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。丙型肝炎的治疗目的是清除病毒，目前干扰素联合利巴韦林是抗丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus,HCV)治疗的最佳方案，但其治愈率仅约50%，且副作用大，临床上约50-60%的丙型肝炎患者无法从中获益。新近上市和目前正在研究的多种蛋白酶抑制剂均需与干扰素联用，单独应用短期内即出现耐药，因而临床迫切需要探索新的治疗手段。现代医学发现一些中药具有抗病毒作用，但针对抗HCV中药筛选的报道极少，且前期研究多采用裸鼠接种实验，成本高，工作强度大，难以做到高通量筛选。本研究采用同时表达新霉素磷酸转移酶和海肾荧光素酶的HCV复制子细胞系sH7(H7-HCV-L7)为实验系统，利用血浆药理学的实验方法，筛选抗HCV中药。由于动物血浆超过一定浓度会对细胞产生毒性作用，所以我们在第一部分首先探讨了在细胞培养条件下动物血浆对细胞的影响，确定了最适血浆来源动物种属及血浆的最佳作用时间和添加浓度；在此基础上，第二部分对16种可能有较高抗HCV作用的中药进行筛选，组方并验证。第一部分细胞培养条件下动物血浆对细胞的影响目的：将H7-HCV-L7细胞接种于裸鼠皮下，制备裸鼠体内适应性细胞系mH7-HCV-L7，使其能承受较高浓度的小鼠血浆；选取适宜的动物血浆，确定血浆的最佳作用时间和添加浓度。方法：1制备裸鼠体内适应性细胞系mH7-HCV-L7并验证：将肿瘤细胞H7-HCV-L7接种于裸鼠皮下，形成肿瘤后荷瘤继续饲养2月；无菌条件下取瘤体，制备裸鼠体内适应性细胞系mH7-HCV-L7并培养；应用CCK-8法对不同浓度(10%、20%、30%、40%)小鼠血浆作用于H7-HCV-L7及mH7-HCV-L7细胞24h、48h、72h的细胞毒性进行比较；2清洁级KM小鼠、Wistar大鼠、新西兰兔血浆，分别以不同浓度(10%、20%、30%、40%)作用于H7-HCV-L7细胞不同时间(24h、48h、72h)后，应用CCK-8法对其细胞毒性进行分析，确定最适血浆来源动物种属及血浆的最佳作用时间和添加浓度。结果：1小鼠血浆作用于H7-HCV-L7及mH7-HCV-L7细胞的细胞毒性比较：1.1随着所添加小鼠血浆浓度的升高，作用时间的延长，H7-HCV-L7及mH7-HCV-L7细胞组的光密度(Optical Density,OD)值均降低，所表现的毒性均增加；1.210%的小鼠血浆作用于mH7-HCV-L7细胞24h及48h后的OD值略高于相应的作用于H7-HCV-L7细胞，其他浓度及时间点则无明显统计学差异；1.310%的小鼠血浆对mH7-HCV-L7细胞仍有较高的毒性(24h、48h、72h细胞存活率分别为75.30%、57.29%、21.12%)2小鼠、大鼠、兔血浆作用于H7-HCV-L7细胞的细胞毒性比较：2.1相应时间点相同浓度的动物血浆比较，均以小鼠血浆的OD值最低，兔血浆的最高，大鼠血浆的居中；2.2相应各组48h的OD值与24h的OD值比较，P＞0.05，统计学无明显差异；相应各组72h的与24h的比较，30%、40%兔血浆组、DMEM对照组，P＜0.05，差异有显著性；2.310%、20%、30%兔血浆组与DMEM对照组48h的OD值比较，P＞0.05，统计学无明显差异，既有血浆本身对细胞的毒性作用，又有其作为营养物质对细胞生长的促进作用；40%兔血浆组与DMEM对照组48h的OD值比较，P＜0.05，则主要表现为抑制H7-HCV-L7细胞生长的作用。结论：1裸鼠体内适应性细胞系mH7-HCV-L7仍然难以容忍较低浓度的小鼠血浆；2以兔血浆最适合H7-HCV-L7的生长，最佳作用时间为48h，考虑血浆中药物成分本身可能对细胞生长产生促进或抑制作用，故为留有余地，确定后续筛选抗HCV中药时兔血浆的添加浓度为20%。第二部分应用血浆药理学方法及HCV复制子筛选抗丙肝中药及组方目的：筛选出对HCV抑制率较高的中药，组方并验证。方法：1应用含有HCV复制子的H7-HCV-L7细胞系及中药血浆药理学实验方法，对16种可能有较高抗HCV作用的中药(黑蕊虎耳草、大血藤、五爪金龙、白雪花、云南美登木、栀子、滇丹参、苦参、鸡爪大黄、山豆根、苦味叶下珠、红腺忍冬、龙胆草、黄芩、肉桂、女贞子)进行筛选：1.1制备含药兔血浆及空白兔血浆；1.2应用CCK-8法及48孔板做H7-HCV-L7的标准曲线；1.3接种细胞于48孔板中，贴壁培养24小时；换液加20%含药兔血浆及20%空白兔血浆，持续作用48小时；1.4应用CCK-8法测定各孔光密度(Optical Density，OD)值，计算细胞存活率及各孔细胞数；1.5应用海肾荧光素酶发光试剂盒及Glomax20/20发光检测仪测定各孔荧光值，计算各孔单个细胞荧光值；1.6计算各中药抗HCV抑制率，从高到低进行排名比较2选取抑制率较高的中药组方并验证2.1根据细胞毒性、抑制率排名、各中药性味功效及临床常用治疗肝病中药方剂，选取中药组方如下：方一：大血藤12g、五爪金龙8g、云南美登木45g、黄芩6g方二：女贞子10g、五味子5g、黄芪20g、党参10g方三：大血藤12g、五爪金龙8g、云南美登木45g、黄芩6g、女贞子10g、五味子5g、黄芪20g、党参10g2.2测定各中药组方抗HCV抑制率并进行排名比较：同方法1。3进一步验证抑制率较高的中药及中药组方：3.1用Promaga公司的SV Total Isolation System，提取中药组方及方一中各中药血浆作用于H7-HCV-L748小时后细胞内的核糖核酸(Ribonucleicacid，RNA)；3.2荧光定量聚合酶链式反应(Ploymerase chain reaction,PCR)检测各组样品HCV RNA拷贝数(copies/mL)；3.3用核酸蛋白分析仪定量各样品中的总RNA浓度(μg/mL)，计算平均每微克总RNA所含HCV RNA拷贝数；计算抑制率，进行排名比较；结果：1利用单个细胞荧光值所计算的抑制率中，20%含大血藤、五爪金龙、云南美登木、黄芩的兔血浆抑制率较高，分别为51.73%、43.46%、32.62%、23.68%，且无明显细胞毒性；中药组方中方三对HCV抑制率最高，方二最低，方一略低于方三。2利用每微克总RNA中HCV RNA拷贝数所计算的抑制率中，以单味中药抑制率高，排名仍为大血藤、五爪金龙、云南美登木、黄芩，而组方抑制率较低；组方间抑制率从高到低排名仍为方三、方一、方二。结论：应用血浆药理学实验方法及HCV复制子筛选抗丙肝中药并组方，验证方一及方三均具有抗HCV的作用，但因方一多为寒凉之品，不宜长期服用，以方三最适宜慢性丙肝的治疗。