富含乌头类生物碱的中药临床应用广泛,常用于心脑血管疾病、风湿性和类风湿性关节炎、消化系统疾病等的治疗。由于其毒性较强,临床使用过程中不良反应和中毒事件较多。此外,该类中药在临床使用过程中常与其他药物甚至西药联合应用,可能引起药物相互作用,但是,相关的研究报道较少。本研究中我们首先建立高效、灵敏的UPLC-MS/MS方法,测定大鼠血浆中乌头碱及其代谢产物;并建立清醒大鼠口服乌头碱诱发的心动过缓和低血压模型,在此基础上分析乌头碱中毒剂量的药代动力学;最后,制备大鼠离体肝微粒体考察乌头碱对CYP450酶系的5种常用探针的动力学影响;以及研究在大鼠肝微粒体中乌头碱与美托洛尔、氯沙坦、氨氯地平的相互作用。第一部分建立检测大鼠血浆中7种乌头类生物碱的UPLC-MS/MS方法目的:研究大鼠口服乌头碱后血浆中的代谢产物。方法:建立高效、灵敏的UPLC-MS/MS方法,快速测定大鼠血浆中7种乌头类生物碱。采用乙酸乙酯对血浆样品进行萃取、纯化,采用电喷雾电离(ESI)、多反应监测(MRM)进行含量测定。结果:1 UPLC-MS/MS的方法学验证采用UPLC-MS/MS方法测定了7种乌头类生物碱,专属性良好,7种乌头类生物碱和内标物质均达到基线分离,且血浆中内源性物质在7种乌头类生物碱和内标物质的出峰位置无干扰。乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、苯甲酰新乌头碱在0.05-20 ng/m L,乌头原碱在0.1-20 ng/m L范围内线性关系良好。乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、苯甲酰新乌头碱、乌头原碱的检测限分别为为5、5、5、5、5、10、20 pg/m L,定量限分别为10、10、20、20、20、20、50 pg/m L。7种乌头类生物碱日内精密度和日间精密度分别低于3.9%、5.3%,回收率和基质效应的范围分别为90.2%-101.3%和90.3%-99.2%。血浆样品室温放置4 h,含量变化不超过10%,在-20°C冰箱中储存30 d和反复冻融3次,稳定性范围分别为90.0%-100.5%和89.4%-100.1%。样品经前处理后,放置于仪器样品室(4o C)4 h或24 h,含量变化范围低于4.4%。2样品测定给药后血浆中新乌头碱、次乌头碱和苯甲酰乌头碱的含量在定量限附近,其他预期的代谢产物包括苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱和乌头原碱均低于检测限。此外,在大鼠血浆中还发现了代谢物M,通过PIC扫描推测该化合物的结构可能为16-O-去甲基乌头碱。第二部分清醒大鼠口服乌头碱的毒性作用及毒代动力学研究目的:建立清醒大鼠口服乌头碱诱发的心动过缓和低血压模型,并对其毒代动力学进行研究。方法:采用美国肯特动物无创血压测定系统,测定大鼠的血压和心率;建立UPLC-MS/MS方法,测定毒性剂量下大鼠血浆中乌头碱及其代谢产物的含量,采用Win Nonlin 5.1软件计算毒性剂量下乌头碱的药代动力学参数。结果:1 UPLC-MS/MS的方法学验证方法学验证的结果同第一部分。2乌头碱对清醒大鼠的心率和血压的影响与给药前及溶媒对照组相比,乌头碱200μg/kg剂量组大鼠的心率在给药后2 h时显著降低(P<0.01),由给药前的(283±10 bpm)降至(200±13bpm),平均下降29%,于给药后4 h迅速恢复(P>0.05);乌头碱400μg/kg剂量组大鼠的心率在给药后2 h和4 h时,均显著降低(P<0.05,P<0.01,),由给药前的(283±11 bpm)分别降至(190±11 bpm)和(228±26bpm),分别下降了33%和19%。与给药前及溶媒对照组相比,乌头碱400μg/kg剂量组大鼠的收缩压和舒张压,仅在给药后2 h时显著下降(P<0.05),由给药前的(115.4±3.3 mm Hg)及(78.9±2.7 mm Hg)降至(102.4±4.5mm Hg)及(69.1±3.7 mm Hg),分别下降了11%和12%。乌头碱200μg/kg剂量组大鼠的血压无显著性改变(P>0.05)。3不同毒性剂量乌头碱的药动学参数口服乌头碱后血药浓度快速上升,200μg/kg组在25.5±5.8 min达到最高血药浓度,C max为7.5±0.8 ng/m L;而400μg/kg组在14.5±1.9 min和131±10 min呈现双峰现象,且C max为7.7±0.9 ng/m L(第二峰);两剂量组的C max无显著差异(P>0.05)。但是,双因素方差分析结果显示,400μg/kg组大鼠在120、180、240、360、480 min的血药浓度均显著高于200μg/kg组大鼠(P<0.05)。与200μg/kg剂量组相比,400μg/kg剂量组的AUC增加了0.8倍(P<0.01),V d值增加了1.2倍(P<0.01),t1/2和MRT均延长了0.7倍(P<0.01),Cl则无显著性改变(P>0.05)。4乌头碱代谢物的检测仅在400μg/kg剂量组的一只大鼠血浆中,定量测定了苯甲酰乌头碱,其含量分别为0.239 ng/m L(90 min)和0.421 ng/m L(120 min)。血浆中新乌头碱和次乌头碱的含量在定量限附近,其他预期的代谢产物包括苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱和乌头原碱均低于检测限。血浆中发现较高含量的化合物M,将200μg/kg和400μg/kg剂量下化合物M的峰面积与相应乌头碱的峰面积进行比较,峰面积比最大值分别为37.2%±1.7%和40.8%±2.3%。两剂量组间比较时,化合物M的峰面积比值的时间变化曲线无显著差异(P>0.05)。第三部分乌头碱对大鼠肝微粒体CYP450酶探针的体外抑制作用目的:考察乌头碱对大鼠肝微粒体CYP450酶5种常用探针的动力学参数的影响方法:采用差速离心法制备大鼠肝微粒体,BCA蛋白质定量法测定肝微粒体蛋白浓度。采用UPLC-MS/MS方法对大鼠肝微粒体中探针药物的含量进行检测。结果:1 UPLC-MS/MS的方法学验证采用UPLC-MS/MS方法测定了5种探针药物。5种探针药物与内标物质均达到基线分离,且出峰位置无內源物质及代谢物干扰。非那西丁、甲苯磺丁脲、睾酮、氯唑沙宗、右美沙芬分别在1-1000、0.5-1000、0.5-1000、5-1000、0.5-1000 nmol/L浓度范围内,线性关系良好。5种探针药物的回收率和基质效应分别在90.7-102.4%和91.2-105.6%范围内,日内、日间精密度分别小于5.7%和5.9%。2大鼠肝微粒体代谢五种探针药物的NADPH依赖性研究不加NADPH再生系统溶液时,5种探针药物均不发生转化。加入NADPH再生系统溶液后,5种探针药物均发生显著的代谢消除,代谢量均在20%左右。研究表明5种探针药物均具有NADPH依赖性。3五种探针药物代谢的动力学研究大鼠肝微粒体代谢右美沙芬、睾酮、氯唑沙宗、非那西丁、甲苯磺丁脲的K m值分别为7.1、63.3、85.3、163.1、75.9μmol/L。4乌头碱对肝微粒体代谢各探针药物的影响乌头碱对右美沙芬、甲苯磺丁脲、非那西丁、睾酮、氯唑沙宗在大鼠肝微粒体中代谢的IC50值分别为13.4、23.5、65.7、66.1、>200μmol/L。5乌头碱对右美沙芬和甲苯磺丁脲代谢抑制类型的考察乌头碱对甲苯磺丁脲的抑制为竞争性抑制,抑制常数Ki为12.5μmol/L;乌头碱对右美沙芬的抑制为竞争性抑制,抑制常数Ki为4.9μmol/L。第四部分大鼠肝微粒体中乌头碱与3种抗高血压药相互作用的研究目的:研究在大鼠肝微粒体中乌头碱与常用抗高血压药的相互作用方法:采用差速离心法制备大鼠肝微粒体,BCA蛋白质定量法测定肝微粒体蛋白浓度。采用UPLC-MS/MS方法对大鼠肝微粒体中3种抗高血压药的含量进行测定。结果:1 UPLC-MS/MS的方法学验证采用UPLC-MS/MS方法检测3种抗高血压药。3种抗高血压药与内标物质均达到基线分离,且出峰位置无內源物质、代谢物干扰。氯沙坦、美托洛尔、氨氯地平分别在5-1000、1-5000、1-1000 nmol/L浓度范围内线性关系良好。3种抗高血压药物的回收率和基质效应范围分别为89.1-104.4%和87.0-100.9%,日内、日间精密度分别小于4.8%和5.3%。2大鼠肝微粒体代谢三种抗高血压药的NADPH依赖性研究不加NADPH再生系统溶液时,3种抗高血压药均不发生转化。加入NADPH再生系统溶液后,3种抗高血压药均发生显著的代谢消除,代谢量均在20%左右。研究表明3种抗高血压药的代谢均具有NADPH依赖性。3三种抗高血压药代谢的动力学研究大鼠肝微粒体代谢氯沙坦、美托洛尔、氨氯地平的K m值分别为5.5、16.7、3.0μmol/L。4乌头碱对肝微粒体代谢3种抗高血压药的影响乌头碱对美托洛尔、氯沙坦、氨氯地平在大鼠肝微粒体中代谢的IC50值分别为16.3、30、>200μmol/L。5乌头碱对氯沙坦和美托洛尔代谢抑制类型的考察乌头碱对氯沙坦的抑制为竞争性抑制,抑制常数Ki为9.54μmol/L;乌头碱对美托洛尔的抑制为竞争性抑制,抑制常数Ki为4.13μmol/L。结论:首次在口服乌头碱后大鼠血浆中检出新乌头碱、次乌头碱以及苯甲酰乌头碱。首次在大鼠血浆中发现16-O-去甲基乌头碱,它可能是乌头碱在大鼠体内主要代谢产物。与低剂量200μg/kg组相比,高剂量400μg/kg组不仅引起清醒大鼠心动过缓且引起低血压,且药动学参数t1/2与V d显著增加而C max未发生变化。乌头碱竞争性抑制大鼠肝微粒体对右美沙芬(CYP2D6)和甲苯磺丁脲(CYP2C9)的代谢,呈中等程度抑制,对非那西丁(CYP1A2)和睾酮(CYP3A4)代谢的抑制作用较弱,不影响氯唑沙宗(CYP2E1)的代谢。乌头碱竞争性抑制大鼠肝微粒体对美托洛尔和氯沙坦的代谢,呈中等程度抑制,而不影响氨氯地平在大鼠肝微粒体中的代谢。