前言:乳腺癌是危害女性身体健康的恶性肿瘤之一,病理学特征为浸润性生长,所以促进乳腺癌发生和生长的相关因子一直是分子生物学的研究重点。目前研究已经证实SIAH2在多种癌组织中都有异常表达。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径中的细胞外信号激酶(ERK)是MAPK家族的重要成员,P-ERK是ERK的活性形式,ERK信号途径因为能够以正性调节的方式调控肿瘤生长而备受关注。已有研究表明SIAH2与P-ERK可能有关联,那么在乳腺癌中SIAH2是否也通过调节活化的ERK途径发挥作用,这对指导乳腺癌的临床诊断和治疗具有重要临床意义。本研究应用免疫组织化学和Western blot检测P-ERK与SIAH2在乳腺组织中和乳腺细胞系的表达情况,并观察两者的表达是否具有相关性,并进一步研究SIAH2和P-ERK表达与临床病理的联系,评价SIAH2是否可能通过ERK通路调节乳腺癌细胞生长。实验结果可为SIAH2小分子抑制剂应用于乳腺癌治疗提供相应的理论依据,为乳腺癌治疗开辟新途径。　　 材料和方法:　　 一、材料　　 (一)临床资料　　 选择中国医科大学附属第一临床医院病理科140例乳腺患者手术切除肿物的存档蜡块(2007年12月至2009年6月)。患者均为女性,年龄24～71岁,平均年龄49.29岁。所有患者术前均未做放化疗以及免疫治疗,有完整的病历资料。依据WHO2003年的乳腺肿瘤组织学分类标准分类,乳腺浸润性导管癌伴淋巴结转移38例,乳腺浸润性导管癌淋巴结无转移38例,乳腺导管原位癌44例,乳腺正常上皮20例。Western blot检测所用的30对乳腺浸润性导管癌(包括在76例浸润性导管癌中)及正常乳腺上皮新鲜组织,切除后立即置于-70℃冰冻保存。　　 (二)细胞系　　 乳腺正常上皮细胞系(MCF-10A)和乳腺癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-435S)本实验储备并由已有的细胞复苏而得。　　 (三)主要试剂　　 鼠抗人SIAH2和P-ERK多克隆抗体,兔抗人ERK多克隆抗体,购自Santa Cruz公司。S-P超敏免疫组化试剂盒(KIT29710)和DAB酶底物显色试剂盒(DAB20030)均购自福州迈新生物技术开发公司。Western blot用,兔抗人多克隆抗β-actin抗体,羊抗兔和兔抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。DMEM购自美国GIBCO。脂质体Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。SIAH2的特异性siRNAs(sc-37497)和SIAH2的非特异性siRNA(control siRNA)序列)(sc5507)购自SantaCruz公司。　　 二、方法　　 (一)免疫组织化学技术　　 按S-P法试剂盒说明书步骤进行P-ERK(1:150)、SIAH2(1:200)抗体免疫组织化学染色。PBS代替一抗作为阴性对照,利用已知阳性片作为阳性对照。阳性判定:以黄色或棕黄色颗粒染色为阳性反应,P-ERK阳性表达于细胞浆和细胞核,SIAH2阳性表达于细胞核。参照温媛媛等[1]报道的方法作为免疫组织化学阳性判断标准,即每张切片在光镜下随机选取5个高倍视野(400倍),每个视野计数100个瘤细胞。根据阳性细胞百分率,无阳性细胞为0分,阳性细胞1％～50％为1分,阳性细胞51％～75％为2分,阳性细胞≥75％为3分;按染色强度:1分呈浅黄色,2分呈黄色,3分呈棕黄色。阳性细胞数评分与染色强度评分相乘后得出综合评分,综合评分≥为阳性表达,＜4为阴性。　　 (二)Western blot技术　　 组织标本处理是,4℃条件下取-70℃冰冻保存1～2g乳腺癌及癌旁组织标本加入约5倍湿重的蛋白裂解缓冲液再充分剪碎,经超声匀浆粉碎后,4℃静置一小时;细胞标本处理是取对数生长期的细胞,加入细胞裂解液后,4℃下静置一小时。组织和细胞标本都在低温高速离心(4℃,12000r/min,30min),提取上清即为总蛋白。经12％的SDS-PAGE电泳、转印,脱脂奶粉封闭,抗β-actin(1:500)和抗P-ERK(1:400)抗SIAH2(1:400)抗ERK(1:400)4℃下孵育,过夜;二抗室温下孵育2h,ECL显色,经自动电泳凝胶成像分析仪采集图像。实验重复三次。　　 (三)细胞培养与SIAH2siRNA干扰　　 MCF-10A,MCF-7,MDA-MB-435S细胞均采用DMEM(含有100UPml青霉素,100UPml硫酸链霉素和10％胎牛血清)培养液,0.1％胰蛋白酶消化传代,在37℃、5％CO2培养箱中培养。实验时,细胞处于对数生长期且细胞活力良好。在预实验中已经确定SIAH2的siRNA(sc-37497)可以有效干扰SIAH2。根据脂质体Lipofectamine2000的说明书,将SIAH2 siRNA瞬时转染至MDA-MB-435S细胞中。　　 三、统计学分析　　 采用SPSS17.0统计学软件,进行Pearson X2检验,Spearmans correlation检验,FisherS精确概率法。P＜0.05有统计学意义。　　 结果:　　 一、SIAH2和P-ERK在乳腺原位癌和乳腺癌中高表达且与组织学分级相关　　 140例乳腺标本免疫组化结果显示,SIAH2阳性率为57.9％(81/140);SIAH2在乳腺正常导管上皮(15.0％)阳性表达率低于乳腺导管原位癌(56.8％)和乳腺浸润性导管癌(69.7％)中SIAH2阳性表达率;统计结果表明SIAH2在乳腺正常导管上皮与乳腺原位癌阳性表达率表达具有差异,SIAH2在乳腺正常导管上皮与乳腺浸润性导管癌阳性表达率表达也具有明显差异。P-ERK阳性率为60.7％(85/140);P-ERK在乳腺正常导管上皮(25.0％)阳性表达率低于乳腺导管原位癌(52.3％)和乳腺浸润性导管癌(75.O％)中P-ERK阳性表达率;P-ERK在乳腺正常导管上皮、乳腺原位癌和乳腺浸润性导管癌表达都具有差异。对76例乳腺浸润性导管癌中SIAH2和P-ERK表达进行相关分析,经spearman相关性检验,结果显示SIAH2和P-ERK表达呈正相关。在76例乳腺浸润性癌中,组织学分级越低,SIAH2和P-ERK阳性表达率越高。SIAH2在ER或PgR高表达病例中阳性率高。　　 二、SIAH2和P-ERK在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中过表达　　 乳腺浸润性导管癌和正常乳腺上皮组织Western blot结果显示:SIAH2和P-ERK在乳腺浸润性导管癌组织中蛋白表达明显高于正常乳腺上皮组织中蛋白表达量,且SIAH2和P-ERK在乳腺浸润性导管癌和正常乳腺上皮组织的蛋白表达量差异具有明显统计学意义。SIAH2和P-ERK在MCF-10A中蛋白表达量明显低于在MCF-7和MDA-MB-435S蛋白表达量,且具有统计学意义。SIAH2在细胞系MDA-MB-435S中蛋白表达高于在MCF-7细胞系蛋白表达且具有统计学意义。　　 三、乳腺癌细胞系中干扰SIAH2表达　　 可下调P-ERK表达在人乳腺癌细胞系MDA-MB-435S转染SIAH2 siRNA后,P-ERK蛋白表明显减少,且具有统计学意义。　　 结论:　　 1、SIAH2,P-ERK过表达与乳腺浸润性导管癌的组织学分级有关。　　 2、在乳腺癌细胞系中抑制SIAH2后P-ERK表达下降。