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研究背景梅尼埃病（Mienere Disease,MD）是一种发病原因及发病机制不明的内耳病变,临床主要表现为发作性眩晕、波动性听力下降、耳鸣和耳闷胀感,MD的患病率逐年上升,其组织病理基础为膜迷路积水。膜迷路积水主要由内淋巴液分泌增多及重吸收减少导致,二者均与离子及液体交换密切有关。溶质载体家族（Solute carrier family,SLC）是人类第二大膜蛋白家族,其中多个亚家族负责离子转运,例如SLC4和SLC26家族转运无机阴离子（碳酸氢根离子等）,SLC22家族主要转运有机阳离子。本研究小组前期利用转录组测序（RNA-sequencing,RNA-seq）技术,分析人外周血单个核细胞转录组谱,发现与正常对照组相比,MD 患者血液中 SLC4A1（Solute carrier family 4 member 1）、SLC4A10（Solute carrier family 4 member 10）表达明显下调。SLC4A10 与SLC4A1结构类似,同属于SLC4亚家族,SLC4亚家族主要负责转运HCO3-,转运HCO3-的亚家族还有SLC26。研究指出,SLC4A1的突变除了会影响肾脏中HCO3-、Cl-的交换,也可以导致听力丧失。SLC4A10在内耳中有表达,并影响小鼠的听力发育,是胚胎小鼠晚期听力损失的筛选基因之一。SLC26家族的SLC26A4（Solute carrier family 26 member 4）蛋白主要在耳蜗、前庭和内淋巴囊（Endolymphatic sac,ELS）中表达,影响内耳的离子和液体转运,导致内淋巴液增加,膜迷路结构扩大。SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4主要转运HCO3-,因HCO3-属于无机阴离子,故以上三种蛋白又称阴离子交换蛋白。以上阴离子交换蛋白与内耳功能关系密切,但与膜迷路积水的关系尚不确定。实验目的本研究首先观察膜迷路积水造模后阴离子交换蛋白SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4在小鼠耳蜗及内淋巴囊的表达变化,之后利用SLC特异性抑制剂DIDS抑制SLC家族成员的表达,观察对照小鼠及造模小鼠膜迷路的组织病理学变化,最后利用RNA-seq技术探讨膜迷路积水可能作用机制。本研究初步探讨了 SLC家族成员在膜迷路积水中的可能作用及分子机制,以期为MD病理进展及治疗等领域提供可用靶点及一定实验支持。实验方法本研究分为3个部分。一、膜迷路积水模型小鼠内耳和ELS中SLCs表达变化1.首先将小鼠随机分为对照组及精氨酸加压素（Arginine vasopressin,AVP）组,对照组无处理,AVP组腹腔注射AVP 8天。2.两组各取部分小鼠,取其颞部进行组织包埋切片,行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色,观察两组小鼠耳蜗、ELS的组织病理学变化。3.两组各取部分小鼠,分别提取耳蜗、ELS总RNA,行实时定量荧光PCR（qRT-PCR）,观察两组小鼠耳蜗、ELS 中 SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4的mRNA表达水平变化。4.两组各取部分小鼠,将其颞部组织包埋切片,行免疫荧光（Immmuofluorescence,IF）染色,观察两组小鼠内耳、ELS 中 SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4蛋白的定位及表达变化。5.两组各取部分小鼠,分别提取耳蜗、ELS中的蛋白,行免疫印迹（Western Blot,WB）实验,观察两组小鼠耳蜗、ELS中SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4的蛋白表达水平变化。二、SLCs低表达后膜迷路积水病理进展1.将小鼠随机分为对照组、AVP组、AVP+DIDS组（DIDS可以抑制SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4）,按组别不同给予无处理、AVP腹腔注射、AVP+DIDS腹腔注射各8天。2.三组各取部分小鼠,分别提取耳蜗、ELS总RNA,行qRT-PCR,观察三组小鼠耳蜗、ELS中SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4的mRNA表达水平变化。3.三组各取部分小鼠,取其颞部组织包埋切片,行IF染色,观察三组小鼠内耳、ELS中SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4蛋白的定位及表达变化。4.三组各取部分小鼠,分别提取耳蜗、ELS中的蛋白,行WB实验,观察三组小鼠耳蜗、ELS中SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4蛋白的表达水平变化。5.三组各取部分小鼠,取其颞部组织包埋切片,行HE染色,观察三组小鼠耳蜗、ELS的组织病理学变化。三、小鼠膜迷路积水的转录组学研究1.将小鼠随机分为对照组、AVP组、AVP+DIDS组,按组别不同给予无处理、AVP腹腔注射、AVP+DIDS腹腔注射各8天。2.三组各取部分小鼠,取耳蜗,行RNA-seq,分析小鼠耳蜗转录组谱,筛选对照组与AVP组、AVP组与AVP+DIDS组的组间差异表达基因;利用基因本体（Gene ontology,GO）功能分析法和京都基因和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路法分析差异表达基因的功能特性和信号转导通路。3.分析对照组与AVP组、AVP组与AVP+DIDS组的组间差异表达基因中的SLCs,分析其表达定位及功能。实验结果一、膜迷路积水模型小鼠内耳及ELS中SLCs表达变化1.小鼠耳蜗及ELS的膜迷路积水表现。与对照组相比,AVP组小鼠耳蜗内前庭膜明显变长,耳蜗及血管纹出现水肿,毛细胞发生空泡化,边缘细胞胞质突起。AVP组前庭膜长度（IR-L）和蜗管横截面积（IR-S）显著大于对照组;AVP组的ELS中间和远端部分显著增大,ELS的管腔也明显扩张,上皮细胞变薄,侧向细胞间隙塌陷。计算ELS横截面积（ELS-S）并统计分析,发现AVP组小鼠的ELS-S明显大于对照组。2.SLCs mRNA的表达变化。鉴于mRNA的定量变化较蛋白水平的半定量变化更敏感,故首先检测SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4 mRNA的表达变化。结果显示,与对照组相比,AVP组小鼠耳蜗及ELS中SLCs的mRNA表达水平均明显下降。3.SLC4A1蛋白的定位及表达变化。IF染色结果显示,SLC4A1在对照组小鼠ELS、内耳的血管纹、螺旋器、膜半规管均有表达;AVP组小鼠ELS和内耳中的SLC4A1表达明显下降。WB结果显示,对照组和AVP组小鼠ELS中的ACTIN蛋白条带基本一致,而AVP组小鼠的SLC4A1的蛋白条带变浅;计算蛋白条带的灰度值并统计分析发现,AVP组小鼠ELS中的SLC4A1表达下降;AVP组小鼠耳蜗中的SLC4A1表达也下降。4.SLC4A10蛋白的定位及表达变化。结构上SLC4A10与SLC4A1基本一致,IF染色结果显示SLC4A10在对照组小鼠ELS和内耳的血管纹、螺旋器、膜半规管均有表达;AVP组小鼠ELS和内耳中的SLC4A10表达下降。WB结果显示,AVP组小鼠ELS及耳蜗中的SLC4A10表达下降,其趋势同SLC4A1表达变化。5.SLC26A4蛋白的定位及表达变化。IF染色结果显示,对照组小鼠的ELS和膜半规管均表达SLC26A4;在血管纹及螺旋器的中心区域无SLC26A4表达,周围区域可见SLC26A4的表达。AVP组小鼠ELS和内耳中的SLC26A4也表达下降。WB结果显示,AVP组小鼠ELS及耳蜗中的SLC26A4也表达下降,其趋势同SLC4A1、SLC4A10表达变化。二、SLCs低表达后加剧膜迷路积水病理进展1.DIDS导致SLCsmRNA表达降低。鉴于mRNA的定量变化较敏感,故在应用DIDS后首先检测SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4 mRNA的表达变化。结果显示,相较于AVP组耳蜗及ELS的mRNA表达水平,AVP+DIDS组耳蜗及ELS的SLCs mRNA表达进一步下降。这说明了DIDS可导致SLCs mRNA表达下降。2.DIDS导致SLC4A1蛋白表达降低。IF染色结果显示,与对照组相比,AVP组小鼠SLC4A1在ELS和内耳中表达明显下降,AVP+DIDS组中SLC4A1表达较AVP组进一步下调,且耳蜗毛细胞空泡化、ELS中的侧向细胞间隙塌陷较AVP组进一步加重。WB结果显示,对照组、AVP组、AVP+DIDS组小鼠ELS和耳蜗中的ACTIN蛋白条带亮度基本一致,对照组SLC4A1的表达正常,AVP组SLC4A1的表达减少,AVP+DIDS组SLC4A1的表达更少;计算蛋白条带的灰度值并统计分析发现,AVP组小鼠的SLC4A1蛋白表达下降,AVP+DIDS组小鼠耳蜗中的SLC4A1表达较AVP组进一步下降。3.DIDS导致SLC4A10蛋白表达降低。IF染色结果显示,AVP组小鼠ELS和内耳中的SLC4A10表达较对照组明显下降,AVP+DIDS组中SLC4A10表达则比AVP组进一步下调。WB结果显示,对照组、AVP组、AVP+DIDS组小鼠ELS和耳蜗中的ACTIN蛋白条带亮度基本一致;相较对照组,AVP组、AVP+DIDS组小鼠ELS及耳蜗中的SLC4A10表达逐渐下降,其趋势同SLC4A1表达变化。4.DIDS导致SLC26A4蛋白表达降低。IF染色结果显示,AVP组小鼠ELS和内耳中的SLC26A4表达较对照组明显下降,AVP+DIDS组中SLC26A4表达较AVP组进一步下调。WB结果显示,AVP组、AVP+DIDS组小鼠ELS及耳蜗中的ACTIN表达基本一致,SLC26A4表达逐渐下降,其趋势同SLC4A1、SLC4A10表达变化。6.SLCs低表达加剧膜迷路积水病理进展。HE染色结果显示,与AVP组相比,AVP+DIDS组小鼠耳蜗前庭膜更长,水肿更明显,小鼠ELS的中间和远端部分增大也更为显著。统计分析发现AVP+DIDS组小鼠的IR-L、IR-S、ELS-S显著大于对照组及AVP组。三、小鼠膜迷路积水的转录组学研究1.采用 FPKM（Fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）度量指标对转录本的表达量进行计算,对照组和AVP组两组样本中检测到32753个基因,通过筛选,两组间共有92个差异表达基因。将差异表达基因进行GO功能富集分析,表达量较高的生物过程包括“细胞过程”、“细胞成分”、“生物调节”和“细胞连接”等。这些差异表达基因涉及很多信号传导途径,如“长寿信号通路”、“钙通路”、“雌激素信号通路”和“PI3K-Akt信号通路”等。分析对照组及AVP组间差异表达基因中的SLCs。AVP组SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4、SLC4A5、SLC4A3明显下降,这五者主要参与碳酸氢根离子的交换;SLC22A4、SLC38A3呈明显上升,主要负责阳离子的转运;SLC25A18、SLC2A9也表达升高,前者主要参与蛋白质的翻译过程,后者涉及葡萄糖转运。2.同上方法计算,发现AVP组和AVP+DIDS组两组样本中可检测到32670个基因,满足条件的有25个差异表达基因。GO功能富集分析表明,差异表达基因表达量较高的生物过程包括“免疫系统过程”、“细胞成分”和“细胞连接”等。这些差异表达基因涉及的信号传导途径包括“蛋白质消化吸收通路”、“C型凝集素受体信号通路”和“细胞粘附分子通路”等。分析AVP组及AVP+DIDS组间差异表达基因中的SLCs。AVP+DIDS组可导致 SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4 明显下降;SLC22A15 明显上升,主要负责阳离子的转运;SLC25A45、SLC2A6明显升高,前者主要参与蛋白质的翻译过程,后者涉及葡萄糖转运;SLC6A3、SLC16A3、SLC15A3也明显升高,这三者都可以参与DNA模板化过程。结论第一:AVP导致小鼠膜迷路积水后,小鼠内耳及ELS中溶质载体家族的阴离子蛋白SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4表达水平明显下降。第二:DIDS 使 AVP 小鼠内耳及 ELS 中 SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4 的表达进一步下降,膜迷路积水程度加重。第三:分析对照组和AVP组、AVP组和AVP+DIDS组组间差异表达基因,发现SLC家族成员中主要是SLC4A1、SLC4A10、SLC26A4基因下调,这也提示了碳酸氢盐离子转运家族对于膜迷路积水很重要。