论文部分内容阅读
近年来,人类健康依然受到癌症的极大威胁,恶性肿瘤的发病率居高不下,并趋向年轻化。由于癌细胞增殖迅速且容易在体内扩散,早期的准确诊断和有效治疗,有助于提高癌症病人的存活率并减少病人的痛苦。手术、化疗和放疗等许多治疗手段被广泛用于临床癌症治疗。然而,早期未转移的实体瘤通常用手术治疗进行切除,但是已转移的肿瘤和非实体瘤不适用。同样的,化疗药的全身毒性、耐药性和低选择性常常导致治疗的结果差强人意。要解决这些问题,就迫切需要制定新的治疗方案来提高治愈率和减少癌症治疗过程中带来的副作用和耐药情况。近年的研究表明,核酸适配体可以成功运载小分子并对肿瘤细胞表面的过表达蛋白有特异性识别和结合功能,可作为靶标用于药物运递送。同时,超顺磁性纳米粒子尺寸很小,表面易于修饰,因此可以发挥包括药物递送,治疗和成像在内的多种功能,在多功能磁共振成像,靶向药物递送,磁热疗中被广泛使用。本论文以表面修饰的超顺磁纳米粒子为载体,利用适配体在其表面进行功能化修饰,再固载化疗药物道诺霉素(DNM)和光敏剂四甲基吡啶卟啉(TMPyP),成功构建了具有磁/适体双重靶向功能的、化学疗法与光动力疗法协同作用的药物递送体系,并在体外和细胞学水平上评估该复合物的稳定性、靶向性、敏感型递送效率、光敏性、迁移抑制和细胞毒性等,具体研究内容如下:首先利用COOH@SPION和氨基化的Apt-S8/Apt-gc34核酸适配体构建出一种新型靶向递送系统,详细步骤如下:(一)构建DNM&TMPyP&Apt-S8/Apt-gc34@SPION递送系统并进行体外抗肿瘤活性检测利用EDC/NHS反应将COOH@SPION与氨基化的Apt-S8/Apt-gc34结合,利用AS1411适配体的G-四链体结构和尾端富GC结构的发夹型结构将药物TMPyP和DNM分别负载到适配体修饰的磁性纳米粒子上。研究结果表明,载药体系极易被肿瘤细胞摄取,其中的DNM的在肿瘤细胞内部存在pH依赖性释放;核仁素适配体(AS1411)封闭实验证明载药体系通过适配体AS1411与穿梭蛋白核仁素特异性结合内化进入肿瘤细胞;避光实验结果证实TMPyP光照后产生的ROS起到了抑制肿瘤增殖作用,进一步细胞凋亡和蛋白免疫印迹实验表明,在光照条件下诱导了细胞凋亡,凋亡过程中的相关蛋白bcl-2和c-myc的表达均下调。(二)构建DNM&TMPyP&Apt-PSA&PEI@SPION递送系统并进行体外抗肿瘤活性检测在上述研究的基础上,将适配体AS1411与p-gp siRNA通过GC G碱基互补自组装成DNA-RNA杂交链)(Apt-PSA)。利用PEI修饰的SPION带正电荷的特点,将上述杂交链Apt-PSA通过静电力作用复合到SPION表面,进一步构建了DNM&TMPyP&Apt-PSA&PEI@SPION新型靶向递送系统。随后的RT-PCR实验与蛋白免疫印迹实验表明,MCF-7/ADR细胞中耐药蛋白p-gp表达量明显降低,证明p-gp siRNA对MDR1基因的有效沉默。(三)构建DNM&TMPyP&PND&Bio-gc34&PSA&PEI@SPION递送系统并进行体外抗肿瘤活性检测将生物素修饰的单链寡核苷酸gc34(Bio-gc34)、p-gp siRNA分别与PEI修饰的SPION通过静电力作用复合到SPION表面。将具有增敏作用的PND、DNM、TMPyP负载到退火后的Bio-gc34上,进一步构建了DNM&TMPyP&PND&Bio-gc34&PSA&PEI@SPION新型靶向递送系统。通过细胞毒性实验可以证实与单纯的DNM药物相比,DNM&TMPyP&PND&Bio-gc34&PSA&PEI@SPION对MCF-7/A DR的IC50存在显著性差异。RT-PCR实验与蛋白免疫印迹实验结果表明,体系作用后,MCF-7/ADR细胞中耐药蛋白p-gp表达量明显降低,证明p-gp siRNA能够有效沉默MDR1基因。本实验结果验证了DNM&TMPyP&PND&Bio-gc34&PSA&PEI@SPION系统多疗法协同作用,减少了化疗药DNM的用量;PND能够竞争性的与p-gp蛋白结合,减少了DNM被转运出细胞的概率,保证DNM在细胞内的有效浓度;同时联合p-gp siRNA下调了MDR1基因表达,达到三重抑制p-gp蛋白的作用,为耐药乳腺癌的治疗研究提供了一种新思路和新方法。