乌珠穆沁羊是我国优良地方品种羊,具有抗逆性强、肉质鲜美、产肉率高等特点。但是随着饲养方式的转变,乌珠穆沁羊长脂尾已近乎失去其重要的意义,并且会给养殖户带来经济损失,在绵羊选育过程中短而细的尾巴更加具有优势。T-box转录因子Brachyury基因是哺乳动物胚胎发育的重要基因,主要调控胚胎的中胚层形成和分化。通过试验验证突变的Brachyury基因将导致脊椎动物无尾或短尾的形成。多数研究是通过RNAi技术或杂交育种的方式来实现对Brachyury基因突变,但是RNAi存在着位置效应、临时性和不完全敲除的缺点,并且杂交育种具有周期性长和成本高的缺点。近年来第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9快速发展,它可以对特定基因组造成DNA双链的断裂从而刺激细胞内源性修复机制完成修复。CRISPR/Cas9基因编辑系统被广泛的应用于家畜的遗传育种,可以对动物的基因组产生缺失、插入以及点突变的基因修饰。因此,本试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对乌珠穆沁羊成纤维细胞的Brachyury基因进行敲除来获得阳性单克隆并为后续研究提供细胞材料。本试验研究对象是乌珠穆沁羊成纤维细胞,选择Brachyury基因作为打靶基因,把敲除作为研究目标。共设计针对Brachyury基因的3个sg RNA,并通过错配核酸酶T7 Endonuclease I对打靶载体活力进行检测。利用组织贴壁法获得乌珠穆沁羊耳成纤维原代细胞,通过优化的电转染程序将CRISPR/Cas9打靶载体瞬时转染到乌珠穆沁羊耳成纤维原代细胞中,利用有限稀释法来获得单克隆,通过T-A分型鉴定单克隆细胞的基因型。综上述本试验共获得单等位敲除乌珠穆沁羊成纤维细胞Brachyury基因阳性克隆66个,获得双等位敲除乌珠穆沁羊成纤维细胞Brachyury基因阳性克隆6个,其中都未发生大片段敲除。本试验所获得阳性克隆可以为后续建立短尾型乌珠穆沁羊提供细胞材料,也促进了绵羊短尾形成机制的研究,从而为绵羊育种提供了理论基础和实践依据。