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在肿瘤微环境中,肿瘤细胞利用其表面的程序性死亡配体-1（Programmed cell death protein ligand 1,PD-L1）,与T细胞上程序性死亡受体-1（Programmed cell death protein 1,PD-1）结合,从而避免T细胞对肿瘤细胞的攻击,产生肿瘤免疫逃逸。因此,阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用可作为治疗癌症的一种有效手段。目前已报道的PD-1/PD-L1的小分子抑制剂较少,本研究构建基于SVM模型和遗传算法的小分子自动设计系统、并通过分子对接、分子动力学模拟对所设计生成的候选化合物进行考察,选择两个全新小分子候选化合物作为PD-L1候选抑制剂,并进行了化学合成和体内外生物验证实验,从而证实候选化合物能够阻断PD-1/PD-L1结合,并且具有免疫抗肿瘤活性。本论文共分为以下六部分:1.综述本章主要围绕免疫检查点PD-1/PD-L1通路、计算机模型在药物研发中的研究进展进行综述。首先对PD-1/PD-L1信号通路进行了综述,并且对其小分子抑制剂的研究进展做了总结;然后回顾支持向量机、遗传算法等机器学习算法,以及分子对接、分子动力学模拟在药物虚拟设计筛选方面的应用,为后续研究提供了技术支撑,最后概述本论文拟解决的科学问题及研究思路。2.基于机器学习的PD-L1小分子抑制剂的设计本章旨在结合遗传算法和SVM回归模型构建PD-L1小分子抑制剂自动设计系统。基于1385个已知靶向PD-L1的小分子抑制剂,成功构建了PD-L1小分子抑制剂活性预测SVM回归模型。经过网格搜索算法对模型进行优化,确定最优SVM活性预测模型参数为交叉验证模式为7-Fold,核函数类型为RBF核函数,惩罚因子C为10和参数gamma为0.01,模型性能为:RMSE=0.634,R~2=0.806。使用Python语言,基于遗传算法,以所构建的PD-L1小分子抑制剂活性预测SVM回归模型作为个体适应度评估方法,成功构建PD-L1小分子抑制剂自动设计系统。设置遗传算法的初始化种群规模为100,基因变异概率为0.01,遗传代数为1000,最终自动设计出预测活性较好的470个化合物。3.基于分子模拟的PD-L1小分子抑制剂的评价本章旨在通过分子对接和分子动力学模拟对470个全新候选化合物进行虚拟评价和筛选。首先,通过动力学模拟技术,对阳性对照化合物BMS202和PD-L1二聚体复合物（PDB ID:5J89）的相互作用模式进行分析,确定了PD-L1二聚体蛋白与小分子化合物结合的活性中心,解析出相互作用的关键残基有:THR20、ILE54、VAL55、TYR56、TRP57、MET115、ILE116、SER117、TYR118、ALA121、Asp122、TYR123、Lys124和Arg125;以及氢键、π-π堆积、盐桥等相互作用模式,以此作为蛋白和小分子结合的参照对接模式。其次,通过Autodock vina的柔性对接,筛选得到了亲和力<-12kcal/mol的26个全新化合物,对比参照对接模式,选择化合物PD-1/PDL1-Ser和化合物PD-1/PDL1-Ser-OEt为候选化合物。最终,通过分子动力学模拟技术分别研究了候选化合物PD-L1-Ser和PD-L1-Ser-OEt与PD-L1二聚体复合物的结合轨迹,通过MM/PBSA结合自由能分析,表明候选化合物与PD-L1二聚体的结合稳定,能够作为抑制剂进行进一步研究。4.PD-L1小分子抑制剂的合成本章旨在合成候选化合物PD-L1-Ser和PD-L1-Ser-OEt,为后续的药效评价提供基础。首先,对小分子抑制剂PD-L1-Ser、PD-L1-Ser-OEt进行逆合成分析,确定其合成路线。其次,根据所确定的合成路线来合成化合物。最后,通过核磁氢谱、碳谱和质谱鉴定产物的结构,最终确认得到的产物分别是所设计的化合物PD-L1-Ser和PD-L1-Ser-OEt。5.PD-L1小分子抑制剂的体外活性评价本章旨在考察候选化合物PD-L1-Ser和PD-L1-Ser-OEt的体外生物活性。首先,使用均相时间分辨荧光共振能量转移（HTRF）技术,对两种候选化合物抑制PD-L1结合的能力进行考察。结果显示在1μM浓度下,化合物PD-L1-Ser和PD-L1-Ser-OEt抑制活性分别为50.02%和67.41%,并且在高浓度下均可达到同阳性对照BMS202相似的抑制活性;表明两个候选化合物均具有体外阻断PD-1/PD-L1结合的能力。其次,利用人乳腺癌细胞MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞4T1,考察化合物PD-L1-Ser和PD-L1-Ser-OEt的抑瘤活性,实验结果显示化合物PD-L1-Ser-OEt具有较强的抗肿瘤作用,其对MDA-MB-231和4T1的IC50值分别为338.5μg/m L和174.4μg/m L,而化合物PD-L1-Ser的细胞毒性较弱,对MDA-MB-231和4T1的IC50值分别为402.2μg/m L和303.6μg/m L。6.PD-L1小分子抑制剂的体内免疫抗肿瘤活性研究本章通过构建4T1-荷瘤小鼠模型,考察候选化合物PD-L1-Ser和PD-L1-Ser-OEt的体内免疫抗肿瘤作用。实验结果表明:与正常组相比,给药组的肿瘤生长受到抑制,且PDL1-Ser-OEt给药组的抗肿瘤作用明显优于阳性化合物5-FU的效果,其最高抑瘤率可达93.81%。IFN-γ和IL-4 ELISA实验结果表明化合物PD-L1-Ser和PD-L1-Ser-OEt给药组中,血清IFN-γ和IL-4的浓度均有所提高,表明候选化合物具有体内抑制免疫检查点的作用。综上所述,本研究构建基于机器学习和分子模拟的计算模型,可以高效地设计得到新型PD-L1小分子抑制剂,为免疫检查点小分子抑制剂的开发提供了研究工具以及具有潜力的小分子抑制剂。