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神经干细胞（neural stem cells, NSCs）目前被认为是治疗中枢神经系统损伤最有临床应用前景的细胞，但NSCs的来源、致瘤性以及移植后的免疫排斥反应等诸多方面的问题又面临着巨大的挑战。研究发现，在神经系统受到机械性、化学性或病理性损伤后，损伤区周围的星形胶质细胞能够表达NSCs的特异性标记物nestin，呈现神经前体细胞或NSCs的特性，并且经过体外培养可以获得NSCs，这一现象的发生机制尚未完全明确，据推测可能与星形胶质细胞周围的微环境变化引起星形胶质细胞逆分化有关。因此星形胶质细胞逆分化的特性为神经系统损伤修复提供了一条新的思路。本实验的目的是构建表皮生长因子（Epidermal GrowthFactor, EGF）、睫状神经营养因子（Ciliary Neurotrophic Factor, CNTF）的真核表达载体后，将重组载体在体外细胞模型进行共转染，观察重组载体对反应性星形胶质细胞（Reactive astrocytes, RAS）逆分化的影响，继而将重组载体共转染脊髓损伤大鼠，观察重组载体在体内环境中对RAS逆分化的影响及促进脊髓损伤修复的效果。为下一步从蛋白和基因水平研究EGF、CNTF调节RAS逆分化的分子机制打下基础。本研究共分为三部分。在实验一中，我们将3周龄的SD大鼠脱颈处死后，在无菌、无RNA酶污染、冰冷的条件下利用Trizol试剂提取出大鼠颌下腺及坐骨神经组织总RNA。利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别扩增出EGF及CNTF基因功能片段，电泳分析结束后回收纯化PCR产物，回收产物分别与空白质粒pSecTag2/Hygro B同时进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切，两组酶切产物经T4DNA连接酶作用后，分别转化入感受态大肠杆菌JM109，LB琼脂平板培养过夜。经PCR初筛，两组阳性克隆分别行BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后送测序，测序结果使用BLAST软件与GeneBank数据库进行同源性分析。正确构建成功的载体命名为pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF。随后将重组载体在脂质体试剂Lipofectamine2000的介导下分别单独及共转染cos-7细胞检测重组载体的表达活性。转染48h后分别收集三组细胞培养上清液，Western blot鉴定重组EGF、CNTF蛋白在cos-7细胞各组中的表达情况。结果发现：单独转染pSecTag2/HygroB-EGF、pSecTag2/hygro B-CNTF的cos-7细胞培养上清分别在6kD、22kD左右处出现阳性条带，共转染组在6kD、22kD均出现阳性条带，对照组呈阴性结果。证实重组EGF、CNTF蛋白在cos-7细胞中共表达成功。在实验二中，我们首先在体外分离培养出大鼠脊髓组织的星形胶质细胞，并在体外用细胞划痕的方法建立RAS细胞模型，经免疫荧光染色发现细胞呈GFAP和nestin表达双阳性，说明星形胶质细胞在受到刺激后发生了逆分化，表达神经干细胞的特异性蛋白，这与前期其他学者的研究结果相一致。接着，我们将构建成功的真核表达载体pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF共转染RAS，在RAS中过表达重组EGF、CNTF蛋白，发现随着共转染时间的推移，RAS表达nestin的强度不断增强，培养到第6d，视野中基本都是GFAP和nestin双阳性细胞，nestin的表达强度也有显著提高。而共转染真核表达载体的正常星形胶质细胞未出现nestin阳性细胞。转染空白质粒的RAS仅有少量的GFAP阳性细胞表达nestin，且表达强度相对较弱。并且对nestin的表达进行半定量分析发现，未损伤的正常星形胶质细胞没有明显的表达nestin。转染空白质粒的RAS的nestin表达强度相对较弱。而共转染第2~6d，nestin的表达强度出现逐渐上升的趋势，在第6d时，nestin的表达量达到最高。以转染空白质粒的RAS相对光密度值为1，转染第2d的相对光密度值为1.03±0.13，第4d为1.14±0.16，第6d为1.23±0.27。这些结果提示将重组EGF、CNTF真核表达载体在体外共转染RAS的细胞模型，能够上调RAS的nestin表达，促进RAS的逆分化过程，但是其具体分子机制有待进一步研究。在实验三中，我们将4月龄SPF级SD大鼠随机分为EGF转染组（A组），CNTF转染组（B组），CNTF与EGF共转染组（C组）和对照组（D组）4组，每组24只。采用改良Allen’s法制备大鼠脊髓损伤模型后，应用Alzet微渗透压泵分别向A、B、C组和D组持续转染重组EGF与CNTF质粒和空白质粒各5μg（A组单独EGF转染，B组单独CNTF转染，C组EGF与CNTF共转染，D组为空白质粒）。在术后1、2、4、6周采用BBB运动功能评分系统，斜板运动试验检测大鼠运动功能恢复情况；采用RT-PCR和Western blot方法检测EGF与CNTF基因的表达；采用免疫荧光双标染色和组织学观察EGF与CNTF对反应性星形胶质细胞增殖分化的影响以及脊髓组织病理变化情况。结果发现，术后2、4、6周运动功能评分C组BBB评分明显高于其余三组，差异有统计学意义（P<0.05）。RT-PCR和Western blot方法检测显示A组大鼠脊髓组织可见EGF，B组可见CNTF mRNA与蛋白的表达，C组可见共同表达，而D组则未见明显表达。组织学观察示C组脊髓结构以及神经元形态恢复较好且逐渐趋于正常，且免疫荧光双标染色示C组脊髓组织中Nestin阳性的星形胶质细胞数较对照组明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）。这些结果提示重组EGF、CNTF能够在体内环境中通过促进RAS的逆分化从而促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复。综上所述，在体外RAS细胞模型中过表达EGF和CNTF蛋白能够促进RAS的逆分化过程。在脊髓损伤大鼠中过表达EGF和CNTF蛋白能够促进RAS逆分化过程并且促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复。