第一部分 研究肝癌组织与癌周肝组织中DNA损伤修复分子的表达差异实验目的：探索肝癌组织和癌周肝组织中DNA损伤修复分子的表达差异。实验方法：1.收集肝癌肝切除术病人的癌组织和癌周肝组织。筛选年龄在40岁左右的男性病人,有乙肝病史,且肿瘤最大直径<5cm,经术后病理诊断为原发性肝癌,且分化程度一致的病例,将刚切除下来的标本快速放入冻存管中,加入RNA保存液(RNAwait),放入-80℃冰箱中保存。2.将收集的肝癌组织和癌周肝组织装入含有干冰的低温罐中,送上海伯豪生物有限公司。采用Agilent人全基因谱表达芯片检测肝癌组织和癌周肝组织中DNA损伤修复基因的表达差异。实验结果：1.共收集3例符合条件的肝癌病人的癌组织和癌周肝组织。2.芯片结果发现有33个在肝癌组织和癌周肝组织中差异表达的DNA损伤修复的分子,其中有8个表达差异均在10倍以上。其中XRCC2分子在肝癌中尚未报道,其癌组织中的表达比癌周肝组织表达高出17.5倍。第二部分研究XRCC2分子的表达与肝癌病人临床病理特征和肝切除术后远期疗效的相关性实验目的：扩大样本量验证XRCC2分子在肝癌组织和癌周肝组织之间的表达是否存在差异,并且分析其表达与病人临床病理特征及预后之间的关系。实验方法：1.从我院肝癌标本库中选择2009年1月至2011年1月实施肝切除的肝癌病人的癌组织和癌周肝组织共149对。采用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学技术检测其癌组织和癌周肝组织中XRCC2分子的表达情况。2.收集整理病人的临床病理资料并进行术后随访,分析XRCC2分子的表达与肝癌恶性生物学特性的关系及其对肝癌病人肝切除术后远期疗效的影响。实验结果：1. RT-PCR结果显示有111例(74.5%)肝癌病人癌组织中XRCC2分子的表达明显高于其癌周肝组织。免疫组织化学和Western blot随机检测上述50对肝癌组织和癌周肝组织中XRCC2分子在蛋白水平的表达,也发现其在癌组织中的表达明显高于对应的癌周肝组织。2.根据XRCC2分子在肝癌病人癌组织中相对于癌周肝组织中的表达量,我们将149例肝癌病人分为高表达组(n=111例)和低表达组(n=38例)。结合病人的临床病理资料,发现XRCC2分子表达水平与HBV-DNA滴度、肝硬化程度重、肿瘤分化程度、肿瘤大小及有无包膜密切相关。3.对两组病人进行术后随访,发现XRCC2高表达组病人肝切除术后5年总体生存率和无瘤生存率均明显低于XRCC2低表达组的病人,分别为28.7%、17.8%和54.2%、37.6%,两组之间具有显著的统计学差异(p<0.01)。Cox风险比例回归分析显示,XRCC2分子的表达水平是影响肝癌肝切除术后总体生存和无瘤生存的独立危险因子。第三部分研究XRCC2分子对Be1-7402和SMMC-7721两种肝癌细胞增殖能力的影响实验目的：探讨XRCC2分子对Bel-7402和SMMC-7721两种肝癌细胞系增殖能力的影响。实验方法：1.采用RT-PCR和Western blot的方法检测10中肝癌细胞系和正常肝细胞系中XRCC2分子的表达情况,从中挑选出XRCC2分子的表达量最高和最低的肝癌细胞系进行下一步实验。2.利用shRNA慢病毒转染技术下调肝癌细胞系Bel-7402中XRCC2分子的表达,以过表达慢病毒转染技术上调肝癌细胞系SMMC-7721中XRCC2分子的表达,两种慢病毒均携带有嘌呤霉素抗性基因,从转染后第2天开始,用浓度为5μg/mL的嘌呤霉素筛选阳性细胞,然后采用Western blot和RT-PCR检测上述细胞中XRCC2分子的表达情况。3.采用CCK-8实验、平板克隆形成实验及软琼脂克隆形成实验,检测转染前后Bel-7402细胞核SMMC-7721细胞的体外增殖成瘤能力；利用Edu荧光检测Bel-7402细胞转染前后Edu染核的阳性比例来进一步证实XRCC2分子在肝癌细胞增殖中的作用。4.将Be1-7402和SMMC-7721两种细胞转染前后的细胞分别种植到4周左右的裸鼠皮下,5×106个细胞/只,每组10只,观察和记录各组细胞种植瘤的瘤体的生长变化，每4天记录一次,32天后处死小鼠,取下肿瘤并称重,测量肿瘤的大小,绘制瘤体生长曲线。实验结果：1. Western blot和RT-PCR结果表明,与正常肝细胞系相比,10中常见肝癌细胞系中XRCC2的表达明显升高,其中Bel-7402表达最高,SMMC-7721表达最低,因此,这两种细胞用于后续实验。2. Western blot和RT-PCR检测敲减和过表达的效率,结果表明Bel-7402细胞中XRCC2分子的抑制率约为75%,SMMC-7721细胞中XRCC2分子表达上升约32倍,成功建立敲减和过表达的Bel-7402-sh-XRCC2和SMMC-7721-XRCC2肝癌细胞株以及仅转染空载体的Bel-7402-vec和SMMC-7721-vec对照细胞株。3.CCK-8实验结果表明,Bel-7402-sh-XRCC2组与Bel-7402-vec组相比,从第三天开始,OD450值明显下降(0.45±0.098 vs 1.16±0.21,p<0.01)；SMMC-7721-XRCC2组与SMMC-7721-vec组相比,从培养的第三天开始,OD450值明显升高(1.56±0.18vs 0.72±0.11,p<0.01)；平板克隆实验结果表明,Bel-7402-sh-XRCC2组与Bel-7402-vec组相比,在连续培养12天后,其克隆形成数明显下降(145±16个vs344+24个,p<0.01)；SMMC-7721-XRCC2组与SMMC-7721-vec组相比,克隆形成数明显升高(582±32个vs 410±21个,p<0.05)；琼脂糖克隆形成实验结果显示,Bel-7402-sh-XRCC2组与Bel-7402-vec组相比,在连续培养18天后,其克隆形成数明显下降(49±6个vs 117±9个,p<0.01),SMMC-7721-XRCC2组与SMMC-7721-vec组相比,克隆形成数明显升高(128±10个vs 81±7个,p<0.01)。Edu免疫荧光结果显示,Bel-7402-sh-XRCC2组与Bel-7402-vec组相比,Edu核染色的比例下降约5倍。4.裸鼠皮下种植瘤实验结果显示，Bel-7402-sh-XRCC2组与Bel-7402-vec组相比,肿瘤生长速度明显缓慢,到第32天实验终止时,XRCC2敲减组瘤体大小(0.26±0.05cm3 vs 0.86±0.19cm3)和重量(0.44±0.08g vs 0.11±0.01g)均明显下降(p<0.01);SMMC-7721-XRCC2组与SMMC-7721-vec组相比,肿瘤生长速度明显增加,实验终止时,其瘤体大小(1.82±0.19cm3 vs 1.14：±-0.28cm3)和重量(1.32±0.12gvs 0.54±0.09g)均明显增高(p<0.01)。第四部分研究XRCC2分子调控肝癌细胞Bel-7402和SMMC-7721增殖能力的分子机制实验目的：探讨XRCC2分子调控肝癌细胞系Bel-7402和SMMC-7721增殖能力的可能分子机制。实验方法：1.流式细胞术分别检测肝癌细胞Bel-7402-vec、Bel-7402-sh-XRCC2和肝癌细胞SMMC-7721-vec、SMMC-7721-XRCC2的细胞周期分布情况。2.流式细胞术分别检测肝癌细胞Bel-7402-vec和下调XRCC2分子表达的细胞Bel-7402-sh-XRCC2凋亡水平的变化。3. RT-PCR和Western blot技术检测Bel-7402-vec、Bel-7402-sh-XRCC2和SMMC-7721-vec、SMMC-7721-XRCC2四种肝癌细胞的细胞周期和凋亡相关蛋白的表达水平。4.免疫组织化学检测各组裸鼠皮下种植瘤组织中细胞周期蛋白的表达水平;TUNEL法检测各组裸鼠皮下种植瘤组织中细胞凋亡水平。实验结果：1.流式细胞术检测细胞周期分布显示,Bel-7402-vector组细胞S期所占的比例为10.46%±2.09%,Bel-7402-sh-XRCC2组细胞S期所占的比例为41.08%±3.17%,两组细胞的S期比例差异均具有明显的统计学意义(p<0.01); SMMC-7721-vector细胞S期所占比例为28.87%±2.37%,SMMC-7721-XRCC2细胞S期所占比例为15.65%±2.23%,两组细胞的S期比例差异均具有明显的统计学意义(p<0.01)。2.流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,Bel-7402-vector组细胞凋亡的比例约为1.36%±0.54%,Bel-7402-sh-XRCC2组细胞中凋亡细胞所占的比例为9.80±1.1%,下调XRCC2分子表达后,肝癌细胞的凋亡率明显上升,差异有统计学意义(p<0.05)。3. RT-PCR及Western blot结果显示,肝癌细胞Bel-7402下调XRCC2分子的表达后,Rad51、p53、p21和p15等细胞周期调控因子表达升高,MDM4、PARP-1、cyclinD1和CDK2/4等细胞周期调控蛋白表达下降；促凋亡因子Bax、Caspase-3和c-myc表达升高,而抑凋亡因子Bcl-2表达下降。肝癌细胞SMMC-7721上调XRCC2分子的表达后,MDM4、PARP-1、CDK4和cyclinD1等细胞周期调控因子表达升高,p53、p21表达下降,凋亡因子Bax、Caspase-3、c-myc和Bcl-2的表达未见明显改变。4.免疫组织化学检测种植瘤组织中相应蛋白的表达结果与Western blot检测细胞中蛋白表达的结果一致。Ki67染色结果显示,Bel-7402-sh-XRCC2组的核染阳性细胞数明显低于对照组,TUNEL法检测两种组织中的凋亡率,结果显示Bel-7402-sh-XRCC2组凋亡率明显高于对照组(11.8%±2.8% vs 2.6%±1.0%,/7<0.01)。第五部分研究XRCC2分子的表达在肝癌化疗中的作用实验目的：探讨抑制XRCC2分子的表达能否增加肝癌对米诺环素的化疗敏感性。实验方法：1.CCK-8实验和平板克隆实验检测Bel-7402-vec和Bel-7402-sh-XRCC2两种肝癌细胞分别给予2001μM米诺环素处理前后的增殖情况的变化。2.将Bel-7402-vec和Bel-7402-sh-XRCC2两种肝癌细胞以5x106个细胞／只,每组12只,接种到4周龄裸鼠腋部皮下,待皮下种植瘤长到100 mm3时,再分为两组,一组腹腔注射米诺环素,剂量为20mg/Kg/只,3次／周；另一组腹腔注射等量生理盐水,观察各组细胞皮下种植瘤的生长情况,并记录,40天后处死各实验组小鼠,剥离瘤体,称重,测量体积,绘制瘤体生长曲线,比较各组种植瘤的大小和重量变化。实验结果：1.CCK-8实验结果表明,Bel-7402-sh-XRCC2组与Bel-7402-vec组相比,从第二天开始,其OD450值明显下降(0.48±0.08 Vs 0.93±0.11,p<0.01);Bel-7402-vec组与Bel-7402-vec+mino组相比,连续培养5天后OD450值无明显差异；Bel-7402-sh-XRCC2+mino组与Bel-7402-sh-XRCC2组相比,从第三天开始,其OD450值明显下降(0.39±.07 vs 0.63±0.14,p<0.01);Bel-7402-sh-XRCC2+mino组与Bel-7402-vec+mino组相比,从第三天开始,其OD450值明显下降(0.39±.07 vs1.07±0.12,p<0.01)。平板克隆实验结果表明,Bel-7402-sh-XRCC2组细胞与Bel-7402-vec组细胞相比,在连续培养14天后,其克隆形成数明显下降(124±16个vs 208±21个,p<0.01)；Bel-7402-vec组细胞与Bel-7402-vec+mino相比,其克隆形成数无明显差异(208±21个vs 189±18个);Bel-7402-sh-XRCC2+mino组细胞与Bel-7402-sh-XRCC2组细胞相比,其克隆形成数明显下降(74±9个vs 124±16个,p<0.01)；Bel-7402-sh-XRCC2+mino组细胞与Bel-7402-vec+mino组细胞相比,其克隆形成数明显下降(74±9个vs 189±18个,p<0.01)。2.裸鼠皮下种植瘤生长至第40天,结果发现,Bel-7402-vec组与Bel-7402-vec+mino组相比,瘤体大小(2.44±0.35cm3 vs 2.21±0.29cm3)和重量(0.75±0.083g vs0.66±0.075g)无明显差异；Bel-7402-sh-XRCC2组与Bel-7402-vec组相比,瘤体大小(0.78±0.19cm3 vs 2.44±0.35cm3)和重量(0.24±0.032g vs 0.75±0.083g)均明显下降(p<0.01);Bel-7402-sh-XRCC2+mino组与Bel-7402-vec+mino组相比,瘤体大小(0.32±0.065cm3 vs 2.21±0.29cm3)和重量(0.11±0.023g vs 0.66±0.075g)均明显下降(p<0.01)；Bel-7402-sh-XRCC2+mino组与Bel-7402-sh-XRCC2组相比,瘤体大小(0.32±0.065cm3 vs 0.78±0.19cm3)和瘤体重量(0.11±0.023g vs 0.24±-0.032g)均明显下降(p<0.01)。统计学分析病例资料中的连续变量的数据采用均数±标准差的形式表示,分类变量数据采用百分比的形式表示,采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。连续变量之间的差异采用t检验或单因素方差分析,分类变量之间的差异采用卡方检验,生存分析采用Kaplan Meier法对两组之间的预后进行分析比较。基础实验数据所得的数据均独立重复3次以上,认定p<0.05为差异有显著的统计学意义。结论1.XRCC2分子在肝癌组织中表达明显高于对应的癌周肝组织,且XRCC2分子的表达与肝癌肝切除术后远期疗效呈反比关系。2.肝癌细胞系中XRCC2分子普遍高表达,下调肝癌细胞中XRCC2分子的表达可明显抑制肝癌的增殖能力。3.下调肝癌细胞中XRCC2分子的表达可使肝癌细胞Bel-7402的细胞周期停滞在S期,并促进细胞凋亡。4.下调肝癌细胞Bel-7402中XRCC2分子的表达可明显上调p53和p21蛋白的表达,并且下调MDM4蛋白的表达,提示其可能通过MDM4/p53/p21信号通路调控肝癌的增殖。5.下调肝癌细胞Bel-7402中XRCC2分子的表达后可增强米诺环素对肝癌细胞生长的抑制作用。