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背景焦虑等不良情绪是包括溃疡性结肠炎(UC)在内的炎性肠病(IBD)的重要伴随症状,严重影响患者的生活质量和病情进展。但目前尚缺乏对IBD所伴随的焦虑等情绪的有效防治措施。新近研究显示,UC的重要发病机制是肠道菌群紊乱,而基于“脑—肠轴理论”的大量研究也证实,肠道菌群与焦虑等情绪异常也密切相关。尚有大量研究表明,针灸可以改善焦虑等不良情绪,而且能够促进肠道菌群多样性的恢复。目的本研究探讨针灸改善UC模型小鼠焦虑情绪的作用,以及肠道菌群在此过程中所发挥的作用,以期为针灸治疗UC的作用机制提供新的科学依据,并为后期从“脑—肠轴理论”研究针灸对胃肠道疾病的治疗提供有益借鉴。方法将SPF级雄性昆明小鼠按照完全随机原则分为空白组和DSS组,DSS组以3%的葡聚糖硫酸钠(DSS)建立UC模型。造模成功后,再将DSS组完全随机分为三个亚组,即模型组、电针组和艾灸组。其中,电针组和艾灸组选取“关元”、“足三里”进行治疗,每日1次,每次15min,连续治疗5d,空白组和模型组以相同的方法固定15min。实验期间记录小鼠的体重、大便性状、便血情况,计算疾病活动指数(DAI),治疗结束后以高架十字迷宫(EPM)和旷场(OF)实验进行焦虑样行为测试和血清、下丘脑、结肠和粪便样本的收集。采用HE染色法观察结肠病理组织形态;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、皮质酮(CORT)和5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的浓度;免疫组织化学法(IHC)测定下丘脑区的CRH表达水平,Western Blot法(WB)测定下丘脑和结肠组织的CRH表达水平,并以高通量测序和生物信息学方法分析肠道菌群的多样性。结果1.针灸对UC模型小鼠的治疗效应(1)与空白组比较,模型组小鼠的一般状况较差,毛色晦暗,粪便质稀或呈水样便,肉眼血便或脓血便,体重明显下降(P<0.05),DAI评分明显增加(P<0.05);经电针和艾灸治疗后,UC小鼠的一般状况好转,体重明显增加,DAI评分较模型组明显下降,差异均具有统计学意义(P<0.05),电针组和艾灸组之间比较无显著性差异(P>0.05)。(2)结肠病理形态学结果显示:与空白组比较,模型组小鼠的结肠黏膜不连续,充血水肿明显,腺体数量减少,结构被破坏,脱落杯状细胞增多,黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润及增生;电针组和艾灸组小鼠的结肠组织形态学变化明显改善,腺体数量和黏膜上皮的连续性开始恢复,黏膜下层及基底层有少量炎性细胞浸润,两组之间无明显差异。2.针灸对UC模型小鼠焦虑样行为、脑肠肽CRH和血清CORT、5-HIAA的影响(1)行为学测试结果显示:与空白组比较,模型组小鼠EPM的进入开臂的次数和时间占总的入臂次数和时间的百分比(OE%和OT%)均明显下降(P<0.05);而与模型组比较,电针组和艾灸组小鼠的OE%值和OT%值有一定程度的增高,但差异无统计学意义;但4组小鼠的OF实验结果组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)血清ELISA检测结果显示:与空白组比较,模型组小鼠血清的CRH和CORT浓度均有降低,以CRH降低明显(P<0.05),模型组和电针组小鼠5-HIAA浓度明显升高(P<0.05);模型组、电针组和艾灸组小鼠的CRH、CORT和5-HIAA浓度组间比较差异无统计学意义(P>0.05),但电针组和艾灸组的CRH浓度均有升高。(3)下丘脑CRH水平检测结果显示:免疫组化法染色下,UC模型小鼠下丘脑的CRH阳性细胞较空白组明显减少,着色变浅,平均光密度值明显降低(P<0.05);电针及艾灸治疗后,UC小鼠的阳性细胞数目明显增加,着色变深,平均光密度值明显增高(P<0.05或P<0.01)。Western Blot结果与免疫组化结果相类似,即与空白组比较,模型组小鼠下丘脑CRH的表达明显降低(P<0.05);而电针组和艾灸组小鼠的CRH较模型组表达均有升高,但以艾灸组升高最为明显(P<0.05),两治疗组间比较无显著性差异(P>0.05)。(4)结肠CRH的Western Blot结果显示:与空白组比较,模型组小鼠下丘脑CRH的表达有降低趋势(P>0.05);与模型组比较,电针组和艾灸组小鼠的CRH表达均有升高,但艾灸组升高最为明显(P<0.05),两治疗组间比较统计学意义(P>0.05)。3.针灸对UC模型小鼠肠道菌群的影响(1)物种注释与评估:Rank-Abundance曲线和Pan/Core物种分析结果表明,UC模型小鼠的总物种和核心物种丰富度降低,电针组和艾灸组较模型组升高,且艾灸组高于电针组;α多样性分析表明,模型组、电针组和艾灸组小鼠肠道菌群的ace、chao和sobs指数较空白组均下降,菌群的群落丰富度降低,尤以模型组和电针组下降明显(P<0.05或P<0.01),电针组和艾灸组较模型组有一定的升高(P>0.05),群落丰富度有一定改善,且艾灸的作用较电针明显,而反映群落多样性的shannon和simpson指数四组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)样本比较分析:Beta多样性分析表明,模型组各样本在PCA分析、PCo A分析和NMDS分析平面图的分布与空白组样本所处区域明显不同,相互距离较远,分界较为清楚,而电针组和艾灸组与模型组所处区域有重叠,组间距离较近,但艾灸组与空白组的距离较模型组和电针组近,艾灸作用强于电针。以PLSDA进行样本分组分析表明,模型组、电针组与艾灸组各样本分布较空白组均有明显差异,菌群组间差异较大,电针组与艾灸组的分布与模型组亦有一定的差异,两治疗组分布区域有重叠,菌群组间差异最小。(3)群落组成分析:群落柱形图和群落Heatmap图结果显示,在属分类水平下,毛螺旋菌科的Lachnospiraceae_UCG-001为空白组独有,占4.2%,链球菌属(Streptococcus)为模型组独有,占5.25%;模型组小鼠的拟杆菌属(Bacteroides)、Odoribacter、Allobaculum较空白组明显升高,分别占11.22%、6.23%、10%,乳杆菌属(Lactobacillus)则明显降低,占2.25%,电针组和艾灸组小鼠的乳杆菌属(Lactobacillus)均较模型组升高,分别占8.61%和12.35%,Odoribacter和Allobaculum降低,分别占3.23%、2.2%和0%、1.2%,模型、电针和艾灸三组小鼠的拟杆菌目(Bacteroidales)均较空白组降低,而电针组和艾灸组的毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)所占的比例较模型组升高。(4)选择属分类水平下丰度排在前10的肠道微生物进行物种差异分析,结果显示:Lachnospiraceae_NK4A136_group、norank_f__Bacteroidales_S24-7_group、Lactobacillus、Bacteroides、unclassified_f_Lachnospiraceae、Odoribacter和Lachnoclostridium共7类菌存在组间显著性差异(P<0.05或P<0.01)。其中,模型、电针和艾灸三组的毛螺旋菌科的Lachnospiraceae_NK4A136_group和unclassified_f_Lachnospiraceae较空白组升高,电针组升高尤为明显(P<0.05或P<0.01);三组动物拟杆菌目(Bacteroidales)下的norank_f_Bacteroidales_S24-7_group较空白组降低,电针组尤为明显(P<0.01),而三组的拟杆菌属(Bacteroides)丰度则较空白组升高,电针组尤为明显(P<0.01),且明显高于模型组(P<0.05);模型组小鼠的乳杆菌属(Lactobacillus)较空白组明显降低(P<0.05),而电针组和艾灸组的乳杆菌属丰度均有一定程度的升高,但差异无统计学意义;模型组小鼠的Odoribacter较空白组明显升高(P<0.05),而电针和艾灸组的Odoribacter丰度较模型组有降低。结论:(1)电针和艾灸均能有效改善UC模型小鼠的肠道炎性症状和焦虑样行为,对焦虑相关实验室指标也有改善。(2)电针和艾灸均能够促进UC模型小鼠的肠道菌群多样性的恢复,并对脑-肠轴中重要的组成部分——HPA轴有影响,初步证实了针灸调节脑-肠轴可能是其缓解焦虑样行为的重要机制。