肿瘤干细胞是肿瘤组织中具有自我更新、分化及增殖能力的肿瘤细胞,它们虽只占一小部分,却是肿瘤起源、发展与转移的根源。肿瘤干细胞学说可以较好地解释有关肿瘤的发生、发展、转移与复发及耐药性的问题。人们首先在白血病中分离并鉴定出肿瘤干细胞,并相继在实体瘤中也成功进行了肿瘤干细胞的分选与鉴定,如乳腺癌、脑肿瘤、前列腺癌、头颈部鳞癌、结肠癌等。这些研究结果都是对肿瘤干细胞学说有力的支持。p75^NTR,是一种低亲和性神经营养素受体(neurotrophin receptor p75,p75^NTR),它是一种分子量为75Dalton的蛋白受体,属Ⅰ型跨膜TNF受体超家族成员,它可和NGF、BDNF、NT-3和NT-4等低亲和性结合,在Trk存在条件下被活化,提高对神经营养因子的反应性。是已知的最早分离出来的NTs（neuro-trophins）受体,主要在神经细胞的早期发育过程中丰富表达,通过不同的信号转导通路诱导以神经细胞为主的细胞增殖、迁移、分化、生存、凋亡等。在以往的研究中,p75^NTR曾被用来分离神经冠干细胞,小鼠睾丸小管周平滑肌前体细胞,鼠脂肪多能干细胞和人角膜上皮原始祖细胞等。Okumura等研究证明正常食道上皮细胞中的p75^NTR阳性细胞具有增殖、自我更新及多向分化能力,经鉴定为食道上皮干细胞。本实验通过检测p75^NTR在食管鳞癌组织中的表达与组织分布,采用流式细胞分选技术对食管鳞癌细胞以p75^NTR为标志进行分选,并对其分选得到的p75^NTR阳性和阴性食管鳞癌细胞进行生物学特性研究和基因表达谱差异分析,为从肿瘤干细胞角度研究食管肿瘤的发病机理和寻找新的治疗靶点提供了线索。第一部分p75^NTR在食管鳞癌组织中的表达与组织分布目的:研究p75^NTR在食管鳞癌组织中的表达与组织分布,探寻以p75^NTR作为食道鳞癌干细胞膜蛋白标志进行实验研究的可行性。。方法:100例食管鳞癌石蜡标本,采用免疫组化法检测p75^NTR蛋白的表达,结合p63在食管鳞癌组织中的表达及分布情况来对实验结果统计分析,探寻p75^NTR作为食道鳞癌干细胞膜蛋白标志的可行性。结果:p75^NTR在食管鳞癌组织中的分布与p63大体一致,表现为:在高分化鳞癌中p75^NTR和p63阳性细胞主要分布在鳞癌细胞巢的外围的1～2层,远离表达involucrin的高分化细胞群;与高分化鳞癌相比,中分化鳞癌中的involucrin表达强度显著降低,p75^NTR和p63阳性细胞分布紊乱;低分化鳞癌低表达involucrin,p75^NTR和p63阳性细胞则弥漫分布于整个癌巢。结论:p75^NTR主要表达于幼稚的食管鳞癌细胞中,远离表达involucrin的高分化细胞群,而且p75^NTR阳性细胞在食管鳞癌组织中的定位与p63阳性细胞高度一致,而后者的肿瘤干细胞性质已在皮肤鳞癌和宫颈癌中得到了证实。初步提示p75^NTR可以作为食管鳞癌干细胞的膜蛋白标志。第二部分p75^NTR阳性食管鳞癌细胞的生物学特性研究目的:通过对流式分选获得的p75^NTR阳性和阴性食管鳞癌细胞进行生物学特性研究,探寻p75^NTR阳性食道鳞癌细胞是否具有肿瘤干细胞的特性。方法:通过流式细胞仪分选获取相应p75^NTR阳性和阴性食管鳞癌细胞,进行增殖能力、自我更新和多项分化能力的检测: 1、比较p75^NTR阳性和阴性食管鳞癌细胞生长情况,绘制细胞生长曲线; 2、对p75^NTR阳性和阴性食管鳞癌细胞进行单克隆培养,比较其成克隆能力; 3、培养过程中检测单克隆化的p75^NTR阳性和阴性食管鳞癌子代细胞中p75^NTR阳性比例,判断阳性/阴性细胞是否具有自我更新和多项分化能力; 4、p75^NTR阳性和阴性食管鳞癌细胞成瘤能力的对比。结果:在三株食管鳞癌细胞（Eca109、SHEC-4、SHEC-5）中p75^NTR阳性细胞与p75^NTR阴性细胞相比,其生长均较迅速（P<0.01）;p75^NTR阳性细胞的单克隆形成能力较同源的p75^NTR阴性细胞的单克隆形成能力相比均显著增高（P<0.01）;单克隆化后的p75^NTR阳性细胞中p75^NTR的比例在前5周逐渐下降并分化产生了p75^NTR阴性细胞,并且下降至与分选前的比例相似,此后仍然保持此比例。而单克隆化后的p75^NTR阴性细胞在培养过程中未检测出p75^NTR阳性细胞;p75^NTR阳性细胞与p75^NTR阴性细胞相比,裸鼠体内致瘤能力无显著差异,但p75^NTR阳性细胞组比p75^NTR阴性细胞组成瘤快。结论:75^NTR阳性食管鳞癌细胞具有较强的增殖能力及自我更新和分化能力,能够在产生的子代细胞中保持其细胞特性,并能分化产生其它表型的细胞(p75^NTR阴性细胞)。说明75^NTR阳性食管鳞癌细胞具有肿瘤干细胞的特性。第三部分p75^NTR阳性和p75^NTR阴性食管鳞癌细胞基因表达谱差异分析目的:通过研究p75^NTR阳性和阴性食管鳞癌细胞基因表达谱差异,探寻p75^NTR阳性食道鳞癌细胞中干细胞特性相关基因的表达,为从肿瘤干细胞角度研究食管肿瘤的发病机理和寻找新的治疗靶点提供线索。方法:应用RT-PCR方法比较p75^NTR阳性细胞和p75^NTR阴性细胞的部分基因丰度,包括干细胞特性相关的基因Bmi-1和p63,并采用Affymatrix全基因组表达谱芯片Human Genome U133 Plus 2.0 Array（代表人类全基因组47,000个转录本及对应的38,500个明晰的人类基因）对p75^NTR阳性细胞和p75^NTR阴性细胞进行基因表达谱差异分析。结果:在三株食管鳞癌细胞（Eca109、SHEC-4、SHEC-5）中p75^NTR阳性细胞较之p75^NTR阴性细胞,Bmi-1和p63显著高表达（P<0.01）;在Eca109中p75^NTR阳性细胞中上调基因476条,下调基因398条;根据基因信息检索,目前已初步确定生物学功能的上调基因452条,下调基因382条;根据生物学功能分类结果,初步筛选出和干细胞特性密切相关的与TGF-β和Wnt信号途径相关的上调基因共12条。结论:p75^NTR阳性细胞与p75^NTR阴性细胞比较,p75^NTR阳性食管鳞癌细胞高表达与干细胞特性相关基因（Bmi-1、p63、TGF-β和Wnt等）,进一步证实了p75^NTR阳性食管鳞癌细胞具有肿瘤干细胞特性。为寻找食管鳞癌干细胞靶向治疗提供线索。总之,我们应用流式细胞仪从食管鳞癌细胞株中分离出的p75^NTR阳性细胞具有较强的增殖能力及自我更新和分化能力,并高表达与干细胞特性相关基因,符合肿瘤干细胞的特征,为进一步研究食管肿瘤干细胞提供了一种有效的方法和途径,也为我们进一步从肿瘤干细胞角度研究食管肿瘤的发病机理和寻找新的治疗靶点提供了线索。