目的膝骨关节炎是中老年人常见、多发和比较难治的一种慢性进行性骨关节病,属于中医“骨痹”范畴,其主要病机为肾虚、血瘀。肾虚为本,血瘀为标。所以治疗上着眼补肾壮骨而治本,辅以活血通络止痛而治标。肾中精气亏虚可表现出肾阴虚和肾阳虚两种不同的功能形式,肾阳与肾阴在骨关节炎的疾病发生发展过程中的地位有所不同,其中肾阳不足是骨痹的根本原因,治疗重点在于温补肾阳。本研究拟观察温肾活血中药治疗骨关节炎的临床疗效,以期更好地指导膝骨关节炎的中医临床辨证论治。近年研究表明,退行性改变是骨关节炎关节软骨改变的根本原因。在该病发生与发展过程中,关节软骨发生很多生化、结构和代谢改变,关节软骨出现软化、破坏和局部剥脱。而关节软骨缺损的修复治疗长期以来一直是临床上的难题。其原因主要是由于软骨细胞几乎没有迁移能力,不能迅速聚集到创伤部位所致。此种情况之下,组织工程化软骨的构建可以说为软骨缺损修复开辟了全新的途径,其中干细胞产生的组织工程化软骨成为近年来研究的热点。人间充质干细胞(humen Mesenchymal stromal cells, hMSCs)是一群具有多向分化潜能的均质性细胞,作为种子细胞能够根据微环境信号的指令分别分化为成骨细胞和软骨细胞,适合于伴随软骨下骨损伤的软骨缺损修复。而中医认为“肾生骨髓”,说明了骨、软骨的生长、修复均依赖于肾中精气所提供的濡养和推动,现代医学从骨与软骨代谢、内分泌及间充质干细胞定向分化等进行了研究,认为补肾中药和方剂能促进机体产生促骨、软骨细胞生长的因子而促进成骨、成软骨细胞的增殖与分化。本研究对人骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增鉴定,并通过实验观察温肾中药淫羊藿的有效活性单体成分淫羊藿甙对人骨髓间充质干细胞体外培养增殖的影响以及成软骨细胞的诱导分化的作用,使间充质干细胞的研究从动物实验转向临床研究,研究结果将为中药联合干细胞治疗骨关节炎的临床运用提供依据。方法临床研究所有入选病例均来自广州市中西医结合医院骨科门诊确诊为膝骨关节炎的患者,共80例,利用随机表分为温肾活血组,温肾组,活血组,对照组；温肾活血组予以仙灵骨葆胶囊+化瘀镇痛胶囊口服；温肾组予以仙灵骨葆胶囊口服；活血组予以化瘀镇痛胶囊口服；对照组予以氨基葡萄糖胶囊口服。疗程均为4周。采用膝骨关节炎Ⅱ期临床试验方案的证候半定量评分标准对临床症状、体征、中医证候进治疗前及治疗后评分比较来进行临床疗效评价。实验研究1.收集人骨髓间充质干细胞,经体外扩增培养2到3代,进行细胞形态学观察；并以抗CD29mAb-PE.抗CD44mAb-FITC、抗CD45mAb-PE、抗CD105mAb-FITC、抗CD34mAb-PE、抗CD90mAb-FITC对细胞行单色荧光染色,用流式细胞仪进行细胞表型鉴定。2.观察淫羊藿甙对离体人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的生长作用。实验分5组,空白组,诱导剂组,低剂量淫羊藿甙组,中剂量淫羊藿甙组,高剂量淫羊藿甙组。取第3代细胞接种于培养板上,待细胞贴壁生长后,更换培养基。空白组原培养基继续培养,诱导剂组更换成诱导液,各剂量淫羊藿甙组更换成相应剂量淫羊藿甙+10%FBS H-DMEM培养基。第3天换液1次。分别自加诱导液第1天起,采用MTT法测量每天OD值,取平均值绘制细胞增殖曲线。3.观察中药淫羊藿单体成份淫羊藿甙体外诱导hMSCs成软骨细胞分化作用。收集第3代的细胞,实验分五组：①未诱导组,hMSCs不加诱导剂继续培养。②对照组,加入诱导液(TGF-β10μg/L、DexO.1pmol/L、VitC50mg/L);③淫羊藿甙低剂量组,在含10%FBS H-DMEM培养基中加入淫羊藿甙(终浓度为20μg／L)④淫羊藿甙中剂量组,在含10%FBS H-DMEM培养基中加入淫羊藿甙(终浓度为40μg/L)⑤淫羊藿甙高剂量组,在含10%FBS H-DMEM培养基中加入淫羊藿甙(终浓度为60μg/L)。培养21天,进行荧光显微镜下形态学观察,甲苯胺蓝染色鉴定,Ⅱ型胶原SABC免疫组化法鉴定,胶原mRNA逆转录产物荧光定量PCR分析。结果临床研究1.临床疗效评价：通过两两比较,温肾活血组总体疗效优于其他三组。温肾组、活血组疗效相当,与对照组之间比较无明显差异(P>0.05)。2.治疗前后疼痛积分比较：温肾活血组有显著的疼痛缓解作用(P<0.01),优于其它各组,而温肾组、活血组与对照组疗效相当。3.治疗前后膝部肿胀积分比较：各组间无显著性差异(P>0.05)。4.治疗前后膝关节半蹲或全蹲功能积分比较：温肾活血组改善膝关节半蹲或全蹲功能明显优于其它三组(P<0.01),温肾组、活血组及对照组三组疗效相当(P>0.05)。5.治疗前后上下楼梯功能积分比较：各组之间疗效无显著性差异(P>0.05)。6.治疗前后膝部僵硬积分比较：温肾活血组与温肾组改善膝部僵硬作用明显优于其它两组(P<0.01),活血组与对照组两组疗效相当(P>0.05)。7.治疗前后关节活动度积分比较：组间比较无显著性差异(P>0.05)。8.治疗前后腰膝酸软积分比较：温肾活血组与温肾组改善腰膝酸软作用明显优于其它两组(P<0.01),活血组与对照组两组疗效相当(P>0.05)。9.治疗前后膝关节怕冷症状积分比较：温肾活血组与温肾组改善膝关节怕冷作用明显优于其它两组(P<0.01),活血组与对照组两组疗效相当(P>0.05)。实验研究1.人骨髓间充质干细胞经体外分离,培养,传代,收集第3代细胞,经流式细胞仪细胞表型鉴定符合MSC表型。2. hMSCs的生长曲线呈S形。传代培养第2天,细胞数目稍有增加,第3天开始细胞大量增加,进入对数生长期,尤以第5-6天明显,第7-8天进入细胞生长平台期。空白组、低剂量淫羊藿甙组、中剂量淫羊藿甙组三组细胞增殖无明显差异。诱导剂组、高剂量淫羊藿甙组细胞增殖均较明显。3.荧光显微镜下形态学观察：用小鼠抗人胶原蛋白Ⅱ单抗作为一抗结合,然后以PE标记二抗小鼠IgG结一抗后,在荧光显微镜下观察。高剂量淫羊藿甙组和诱导剂组细胞激发蓝光,表明高表达胶原蛋白Ⅱ, hMSCs分化软骨细胞。中剂量、低剂量淫羊藿甙组细胞发弱蓝光,表明弱表达胶原蛋白Ⅱ, hMSCs分化部分软骨细胞。未诱导组不能观察到蓝光,荧光显微镜下显示不清。甲苯胺蓝染色鉴定：高剂量淫羊藿甙组和诱导剂对照组染色均可见胞浆成紫红色质,表明糖氨聚糖含量丰富,hMSCs成软骨细胞分化；低、中剂量淫羊藿甙组及未诱导组染色未见特征性紫红色异染,表明hMSCs未成软骨分化。Ⅱ型胶原SABC免疫组化法鉴定：高剂量淫羊藿甙组和诱导剂对照组免疫组化染色后可见棕黄色胶原颗粒,高剂量淫羊藿甙组最为密集,表明Ⅱ型胶原含量多,hMSCs成软骨细胞分化显著；低、中剂量淫羊藿甙组见少量棕黄色胶原；未诱导组未见胶原染色。荧光定量PCR检测结果分析：高剂量淫羊藿甙组与诱导剂对照组Ⅰ型和Ⅱ型胶原表达明显。低、中剂量淫羊藿甙Ⅰ型和Ⅱ型胶原表达不显著,未诱导组无胶原表达。结论一、温肾活血法治疗膝骨关节炎疗效确切,该治法在膝骨关节炎的中医临床治疗上具有重要地位。二、人骨髓间充质干细胞可体外培养、扩增。三、温肾中药淫羊藿甙能促进hMSCs增殖并诱导hMSCs成软骨细胞分化。