蛋白内cation-π相互作用的单分子力谱研究

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Cation-π相互作用是指带正电荷的阳离子与富电子π体系芳烃间的静电相互作用。它是一种非常重要的非共价相互作用,在蛋白质折叠、维持蛋白质稳定、分子识别等方面都有着极其重要的作用。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)是脂质运载蛋白家族中的一员,具有保守的二级结构和功能。与其他脂质运载蛋白不同,它能通过cation-π相互作用结合邻苯二酚类嗜铁素从而间接地结合铁,形成嗜铁蛋白-嗜铁素-铁三元复合物,因此又称为嗜铁蛋白。之前人们对于NGAL的生理学意义广泛关注,却极少有人研究NGAL的分子稳定性和cation-π相互作用对力方向性的响应。随着近年来人们对分子间相互作用研究的深入,单分子力谱技术(Single-molecule Force Spectroscopy,SMFS)得到了快速发展和广泛应用。基于原子力显微镜(Atomic Force Microscopy,AFM)的单分子力谱是其中的一种。由于原子力显微镜具有原子级的高空间分辨率,能在接近生理环境的条件下(如溶液中)操作等优点,原子力显微镜单分子力谱法正越来越广泛地应用于分子间相互作用的研究。因此我们利用基于原子力显微镜的单分子力谱对嗜铁蛋白中的cation-π相互作用进行研究。第二章中我们通过单分子力谱的方法研究嗜铁蛋白NGAL中的cation-π相互作用在平行方向上的强度。和共价键相比,cation-π是一类较弱的非共价键相互作用。根据作用的原理,我们认为其具有一定的方向性。我们采用基因定点突变技术在二硫键内部的loop上选取合适的位点进行突变,得到了 cys-GBl-NGAL(Q117C)和(GB1)2-NGAL(P102C)的两个突变蛋白,并在体外构建NGAL-catechol-Fe(Ⅲ)complex,同时对每个突变蛋白进行了以下两组单分子力谱实验:不加Fe(Ⅲ)L3的蛋白作为control和加Fe(Ⅲ)L3的蛋白作为complex。从实验结果我们发现发现力在平行方向作用于NGAL中的cation-π相互作用时,cation-π相互作用强度很弱,使得解折叠信号和解折叠力没有明显变化。第三章中我们通过单分子力谱的方法研究嗜铁蛋白NGAL中的cation-π相互作用垂直方向上的强度。我们利用分子生物学构建得到了 cys-GBl-NGAL(K 124C/T82C)和(GB1)2-NGAL(F 133C/F122C),进行蛋白的表达纯化并在体外构建NGAL-catechol-Fe(Ⅲ)complex,对每个突变蛋白进行control和complex两组单分子力谱实验,以此研究力垂直作用于cation-π相互作用时这个非共价相互作用的强度。实验结果显示,除T82C这种突变外,其余的突变不加Fe(Ⅲ)L3的control和加Fe(Ⅲ)L3的complex的解折叠途径没有很明显的变化,相同的解折叠力只有~20pN的增幅,我们推测cation-π相互作用的强度很小,以至于原子力显微镜不能准确观测到这个强度变化。在下一步的研究中,我们将转向另一种含有cation-π的蛋白,再次进行单分子力谱研究,验证cation-π相互作用的强度大小。通过上述研究结果,我们对于NGAL中cation-π相互作用的方向性进行了科学的阐述,加深了对蛋白质结构内的非共价相互作用的理解。
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