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在自然界中,为了适应复杂多变的外界环境,原核生物需要通过诱导不同σ因子来调控特定基因的转录与表达。σ因子在微生物的进化过程中产生了种类和功能上的差异。根据结构和功能可将其可分为两类:σN因子和σ70家族因子。目前研究较为深入的σ因子为σ70、σ54和σ38。对σ因子的研究大多数都是在转录组水平上,随着研究的深入发现转录因子的调节是一个十分复杂的过程,是诸多因素作用的结果。在原核生物中,其通常以多重调控网络的方式来调节某一外界的刺激应答,许多证据显示转录的激活取决于大量的转录因子的相互作用。在大肠杆菌中发现多个σ因子协同或拮抗调控趋化、鞭毛合成等某些特殊基因的表达。假单胞菌中是否存在和大肠杆菌相类似的调控机制,目前仍不清楚。本研究以施氏假单胞菌A1501为研究对象,构建了rpoN缺失突变株ΔrpoN及其功能互补菌株Comp-rpoN。并利用实验室已有的rpoS缺失突变株ΔrpoS,就RpoN和RpoS对菌株鞭毛合成与趋化的调控进行了相关研究。并取得了以下主要结果: 1.利用三亲本结合的方法构建了rpoN基因缺失突变株和功能回补株。 2.LB培养基中,ΔrpoN生长非常缓慢,稳定期的菌体密度只有野生型的50％;Comp-rpoN的生长恢复到野生型的80%——即rpoN基因突变影响了菌株在正常条件下的生长。而rpoS基因的缺失对菌株生长并没有显著的影响。分别以2MNacl冲击、20mMH2O2冲击处理,ΔrpoS对盐冲击和H2O2冲击比较敏感,ΔrpoS存活率明显下降;而以50℃热冲击后,ΔrpoS的存活率与野生型没有明显差异。 3.在固氮条件下,rpoN基因的缺失使得菌体丧失了固氮能力,Comp-rpoN的固氮酶活性仅恢复到野生型的30%;ΔrpoS的固氮酶活性下降到野生型的75%。 4.趋化实验表明ΔrpoN趋化能力丧失,ΔrpoN丧失了趋化能力,而ΔrpoS趋化能力却增强了。通过透射电镜观察发现,rpoN突变株为鞭毛合成缺陷体;rpoS突变后菌体鞭毛与野生型相比更细、更长。 5.通过phyre2分析发现,RpoN蛋白具有7个α螺旋结构和2个β折叠结构。RpoN具有三个功能结构域,C末端具有保守的RpoN-BoX保守序列:421-IAGLLEAQGIQVARRTVAKYRESLGIAPSSERKRLL-457。RpoS蛋白具有14个α螺旋结构及1个β折叠结构。该蛋白C端DNA-binding氨基酸序列:286-EASTLEEVGQEIGLTRERVRQIQVEALRRLREILERNGLSSDALFQ-332。通过Weblogo预测A1501中依赖RpoN启动子保守结合序列为TGGCACNNNNNTTGC,依赖RpoS启动子保守结合序列为CTANNNTG。 6.利用pTwin1载体构建了pT-rpoN融合表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中导入pT-rpoN表达了RpoN蛋白,并以几丁质柱对其进行纯化。选择鞭毛等级调控系统中的关键调控基因fliA,扩增其上游300bp的序列为探针,通过凝胶阻滞实验发现其与RpoS结合。而没有发现RpoN与fliA探针有结合现象。 7.水稻根系竞争定殖实验显示,rpoN基因的缺失使得菌株的定殖能力显著下降;而ΔrpoS定殖于水稻根系的能力稍有提高。