贝类养殖业是我国重要的海洋经济产业。但近年来,气候变化、环境恶化以及病害多发等问题已严重制约了贝类养殖业的可持续发展。影响贝类生存的主要环境因素包括温度、盐度、溶解氧和重金属等。其中,海水温度能直接影响贝类的存活率、代谢活动和生长发育。温度变化,特别是温度急剧变化显著影响贝类的生理活动、免疫防御功能以及相关基因的表达。因此,探究贝类的生理活动对温度剧烈变化的响应及其机制对于贝类病害预防具有至关重要的意义。本文以我国重要养殖种类虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)为研究对象,采用室内受控实验方法,研究了温度变化对贝类关键生理指标的影响,并对贝类肝胰腺中几种酶活性的变化状况进行了研究;测定了温度剧烈波动下虾夷扇贝细胞免疫指标的变化;研究分析了虾夷扇贝响应温度波动的转录组学变化,并检验了贝类应激相关基因的相对表达状况,旨在为构建贝类养殖风险预警预报和贝类健康养殖提供数据支撑。主要研究结果如下:1.温度变化对贝类关键生理活动的影响根据3种贝类对温度的适应范围,虾夷扇贝设置5°C、10°C和20°C 3个温度梯度,栉孔扇贝和皱纹盘鲍设置5°C、10°C、20°C和25°C 4个温度梯度。每个温度梯度分别设置缓慢变化(1~2°C/d)和急剧变化(从15°C暂养温度直接转移至各实验温度)2个处理,分析不同温度处理方式对其耗氧率、排氨率和摄食率的影响及其差异性。结果表明,在上述温度范围内,虾夷扇贝、栉孔扇贝和皱纹盘鲍耗氧率、排氨率和摄食率随海水温度升高而升高。20°C骤变处理组贝类耗氧率和排氨率显著高于缓变处理组,而5°C骤变处理组贝类摄食率显著低于缓变处理组(P<0.05)。骤变处理组氧氮比(O/N)同缓变处理组间存在显著差异性(P<0.05)。当海水温度剧烈变化时,贝类提高耗氧率和排氨率等生理活动,需要消耗更多的能量,而不利于贝类的生长。另外,温度的剧烈变化可能已经对贝类产生了一定的伤害,导致机体摄食生理活动降低。2.温度剧烈变化对贝类肝胰腺酶活性的影响设置温度骤变(同上)和温度波动(15°C和7°C之间反复波动,每12 h波动一次)2种处理,研究了温度急剧改变后,72 h内虾夷扇贝、栉孔扇贝和皱纹盘鲍肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LSZ)活性以及丙二醛(MDA)含量的变化情况。结果显示,高温骤变处理下,虾夷扇贝、栉孔扇贝和皱纹盘鲍中SOD、CAT、ACP和LSZ的活性显著升高;低温骤变处理组中,虾夷扇贝和皱纹盘鲍中CAT和LSZ的活性显著降低(P<0.05)。5°C骤变处理组中,栉孔扇贝CAT的活性于胁迫3 h和6 h时显著降低,而胁迫12 h后显著升高,并于胁迫12 h达到极其显著水平(P<0.01)。温度波动处理组中,虾夷扇贝、栉孔扇贝和皱纹盘鲍中SOD的活性显著增加,而虾夷扇贝中ACP和LSZ的活性显著降低(P<0.01)。2种温度胁迫处理均能显著增加虾夷扇贝、栉孔扇贝和皱纹盘鲍中MDA的含量(P<0.05)。高温骤变处理后,贝类耗氧率显著提高,体内活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)的含量明显增加,短时间内抗氧化防御系统被激活,增加的抗氧化酶活性(如,SOD和CAT等)清除体内过多的ROS,使机体免受氧化损伤;同时,机体启动免疫防御系统,提高体内相关免疫酶(如,ACP和LSZ等)的活性,增强机体的免疫防御能力。然而,温度急剧改变在激活贝类抗氧化系统和免疫防御系统的同时,长时间的温度胁迫会导致脂质过氧化的发生,并导致细胞的损伤。低温骤变处理中,机体CAT和LSZ等酶活性的显著降低则标志着抗氧化系统和免疫应答系统可能受到一定程度的损伤。3.温度剧烈变化对虾夷扇贝细胞免疫的影响采用流式细胞仪技术对虾夷扇贝血细胞死亡率、血细胞吞噬率和呼吸爆发进行了测定。结果发现,温度骤变处理和反复波动处理组中,虾夷扇贝血细胞死亡率均显著增加;而在25°C骤变处理组中,血细胞吞噬率明显低于对照组水平(P<0.05)。不同温度胁迫处理下,虾夷扇贝的血细胞呼吸爆发也呈现不同程度的增加,5°C骤变处理组中血细胞呼吸爆发于24 h达到最高,为818.86。温度剧烈变化在一定程度上抑制了虾夷扇贝的免疫机能,血细胞的吞噬活性降低,死细胞的移除能力下降。同时,温度胁迫会导致血细胞呼吸爆发的产生,体内积累大量的ROS,过量的ROS如若不及时去除,则会对机体造成一定的伤害。4.虾夷扇贝响应温度波动的转录组学变化通过对温度反复波动处理下的虾夷扇贝鳃组织进行转录组测序分析,共得到59.11×106条clean reads。Trinity拼接共得到了210780条unigenes,其中54529条unigenes在现有的7大数据库中得到注释。通过GO分类、KOG分类和KEGG代谢通路分析发现,6580个unigenes参与虾夷扇贝免疫系统过程和刺激应答过程;2276个unigenes参与虾夷扇贝环境信息处理过程中的25个信号转导途径;755个unigenes参与虾夷扇贝的免疫系统中的16条不同的免疫途径。比较2个不同温度波动处理组(TA处理组:18°C和13°C之间反复波动,每12 h波动一次;TB处理组:18°C和8°C之间反复波动,每4 h波动一次)和对照组间的转录组测序结果,TA处理组筛选得到差异表达的unigenes有548个,其中316个上调表达,232个下调表达。TB处理组筛选得到差异表达的unigenes有229个,其中118个上调表达,111个下调表达。对差异基因进行GO分类分析,TA处理组中548条差异基因中的215条unigenes被注释,它们被分类在44个GO terms中;TB处理组中229条差异基因中的106条unigenes被注释,被分类到38个GO terms中,主要包括结合、细胞过程、单生物过程、催化活性、细胞、细胞组分、应激反应和免疫过程等。对获得的差异基因序列和注释信息进行深入分析,发现有47个unigenes与应激相关。KEGG代谢通路富集分析发现,TA温度处理组中的548个差异表达基因定位至75个特定KEGG代谢通路中,TB温度处理组中的229个差异表达基因定位至46个特定KEGG代谢通路中。5.温度剧烈变化对贝类Hsp70表达的影响采用实时荧光定量PCR技术,对不同温度胁迫处理下虾夷扇贝、栉孔扇贝和皱纹盘鲍血细胞、鳃和肌肉组织中Hsp70的表达情况进行了研究。结果表明,温度和时间对虾夷扇贝、栉孔扇贝和皱纹盘鲍Hsp70相对表达量的影响具有交互作用。5°C和20°C温度骤变处理组中,虾夷扇贝血细胞和鳃组织中Hsp70的相对表达量显著增加(P<0.01);胁迫后的3 h、24 h和48 h,虾夷扇贝肌肉组织中Hsp70的相对表达量显著低于对照组水平(P<0.05)。温度骤变处理显著增加了栉孔扇贝血细胞和鳃组织中Hsp70的相对表达量;而肌肉组织中,Hsp70于低温胁迫后的6 h、9 h和12 h呈显著下调表达模式(P<0.05)。皱纹盘鲍由15°C转移至5°C后,血细胞、鳃和肌肉组织中Hsp70的相对表达量显著提高(P<0.01)。同骤变处理相似,温度波动处理同样对虾夷扇贝、栉孔扇贝和皱纹盘鲍中Hsp70的表达影响显著,其相对表达量出现不同程度的增加。温度剧烈变化下,贝类各组织中Hsp70的过表达意味着细胞正在遭受压力,作为分子伴侣,增加的HSP70通过降解变性蛋白和帮助新生蛋白质的合成,防止细胞受到伤害,提高贝类对环境的适应能力。而Hsp70的转录和翻译等过程是一个耗能过程,长时间处于温度胁迫会对细胞造成一定程度的伤害。