一、研究背景气道重塑是支气管哮喘(哮喘)的病理特征之一,是导致哮喘气道高反应性和气流受限的关键因素,彻底控制或延缓气道重塑,对哮喘尤其是难治性哮喘的治疗及改善预后有重要意义。有文献报道气道平滑肌细胞(ASMC)可通过细胞增殖、释放多种炎症介质、生长因子及细胞外基质(ECM)蛋白参与气道重塑。而Thomson等认为,由ASMC分泌的ECM蛋白占气道重塑组分的50%之多,是气道重塑的关键因素。ECM主要由成纤维细胞和ASMC等气道结构细胞产生,发挥机械支撑作用以维持气道功能。在慢性哮喘患者气道中ECM的质和量都有明显的改变,如胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ,纤连蛋白,细胞粘合素,透明质酸,多功能蛋白聚糖及层粘连蛋白表达增加,而胶原蛋白Ⅳ、弹性蛋白及核心蛋白多糖表达减少。目前,糖皮质激素是治疗哮喘的主要药物,能够很好地控制和缓解哮喘发作,但无法完全阻止和逆转气道重塑的发展,因此,研究气道平滑肌细胞分泌ECM蛋白的机制,对控制气道重塑具有十分重要的意义。长久以来,乙酰胆碱(Ach)仅被看作为副交感神经系统释放的一种神经递质,在哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)中,通过激活气道平滑肌细胞和黏液生成细胞上的毒蕈碱受体而引起支气管收缩和腺体分泌。Ach可以由神经元、上皮细胞、气道成纤维细胞及气道平滑肌细胞合成。近年来,越来越多的证据表明,不论是神经源性还是非神经源性Ach都可能参与调控气道炎症和气道重塑。这些发现使得人们重新审视M受体阻滞剂在治疗哮喘和COPD中的作用——不仅可以缓解气道阻塞,还可能控制气道炎症和气道重塑。β-连环蛋白是Armadillo蛋白家族中的一员,与细胞粘合连接处的钙粘蛋白/连环蛋白复合物相关,发挥稳定细胞-细胞接触的作用。有文献报道β-连环蛋白通过稳定细胞间的接触而调节ASMC的主动张力。同时,β-连环蛋白在经典的Wnt/β-连环蛋白信号通路中调节T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)介导的基因转录。近年来有研究发现Wnt/β-连环蛋白信号通路与某些增生性疾病有关,如特发性肺纤维化等。此外,还有实验研究发现β-连环蛋白在TGF-β1诱导人气道平滑肌细胞ECM蛋白表达中发挥重要的调控作用。综上所述,抗胆碱能药物可能在对抗气道重塑的发生发展中具有一定的作用。此外,β-连环蛋白可能在乙酰胆碱诱导人气道平滑肌细胞表达ECM蛋白的过程中发挥重要作用,成为控制气道重塑的新的治疗靶点。二、研究目的1.原代培养人ASMC,观察其在体外培养时的特点,并鉴定所培养的细胞为平滑肌细胞。2.探讨乙酰甲胆碱(Mch)对人气道平滑肌细胞ECM蛋白表达的作用,并观察长效抗胆碱能药物噻托溴铵对上述作用的影响。3.探讨Wnt/β-连环蛋白信号通路在Mch诱导人气道平滑肌细胞ECM蛋白表达中的作用,并观察Wnt/β-连环蛋白信号通路药理学抑制剂PKF115-584对上述作用的影响。三、研究方法(一)气道平滑肌细胞原代培养及鉴定1.原代培养:取南方医院心胸外科肺叶切除术患者手术标本,在无菌条件下分离叶、段支气管平滑肌层,剪成约1mm3大小,均匀贴于培养瓶底,加入含20%胎牛血清的DMEM,置于37℃、5%CO2孵箱中培养。2.传代培养:待细胞从组织块周围爬出并生长融合,达到培养皿底面积的80～90%时,以1:1～1:2的比例进行传代,用含10%胎牛血清的DMEM培养。3.细胞鉴定:对所培养的细胞进行α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)特异性染色,用免疫荧光法鉴定其是否为平滑肌细胞。4.后续处理:取3～6代对数生长期细胞,以1×104/cm2接种于培养皿,用于后续实验研究。(二)Mch对人ASMC细胞外基质蛋白表达的作用1.细胞准备:将细胞接种于35mm/60mm培养皿中,待细胞生长至占培养皿底面积70～80%时,收集细胞,用于提取总RNA或总蛋白。2.浓度梯度:以0.1ng/ml～10ng/ml浓度的Mch作用于细胞24h,检测胶原蛋白Ⅰ α1的蛋白表达水平,观察各个浓度Mch对ECM蛋白表达的影响。3.时间梯度:以最佳浓度的Mch作用于细胞0～48h,检测胶原蛋白Ⅰ α1的蛋白表达水平,观察Mch刺激细胞不同时间对ECM蛋白表达的影响。4.分组:细胞随机分为对照组和Mch组,给予相应刺激24h后,检测不同ECM蛋白mRNA的表达。5.检测胶原蛋白Ⅰ α1的蛋白表达:将细胞接种于60mm培养皿中,用于提取细胞总蛋白,Western Blot检测各组胶原蛋白Ⅰ α1表达水平,以GAPDH作为内参,计算胶原蛋白Ⅰ α1与GAPDH条带灰度值之比表示胶原蛋白Ⅰ α1蛋白表达水平。6.检测不同ECM蛋白mRNA表达:将细胞接种于35mm培养皿中,用于提取细胞总RNA,并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR对胶原蛋白Ⅰ α1、纤连蛋白、多功能蛋白聚糖、层粘连蛋白α2、核心蛋白多糖特异性片段进行扩增,读取各组CT值,计算2-ΔΔCT值表示ECM蛋白mRNA相对表达量。7.统计分析:所有数据均为计量资料,数值均以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件,进行多组间总体均数比较,若方差齐采用单因素方差分析(one-way ANOVA),若方差不齐采用Welch校正检验。多重比较时,方差齐时采用LSD法检验,方差不齐时采用Dunnett’s T3法检验。检验水准为α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。(三)噻托溴铵对Mch诱导人气道平滑肌细胞ECM蛋白表达的抑制作用1.细胞准备:将细胞接种于35mm/60mm培养皿中,待细胞生长至占培养皿底面积70～80%时,收集细胞,用于提取总RNA或总蛋白。2.分组:细胞随机分为对照组、Mch组、噻托溴铵(Tiotropium)组和(Mch+Tiotropium)组;先用塞托溴铵预刺激细胞30分钟,再加入Mch刺激24h。3.检测胶原蛋白Ⅰα1的蛋白表达水平:将细胞接种于60mm培养皿中,提取细胞总蛋白,Western Blot检测各组胶原蛋白Ⅰ α1表达水平,以GAPDH作为内参,计算胶原蛋白Ⅰ α1与GAPDH条带灰度值之比表示胶原蛋白Ⅰ α1蛋白表达水平;4.检测不同ECM蛋白mRNA表达:将细胞接种于35mm培养皿中培养,提取细胞总RNA,并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR对胶原蛋白Ⅰ α1、纤连蛋白、多功能蛋白聚糖特异性片段进行扩增,读取各组CT值,计算2-ΔΔCT值表示ECM蛋白mRNA相对表达量。5.统计分析:所有数据均为计量资料,数值均以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件,进行多组间总体均数比较,若方差齐采用单因素方差分析(one-way ANOVA),若方差不齐采用Welch校正检验。多重比较时,方差齐时采用LSD法检验,方差不齐时采用Dunnett’s T3法检验。检验水准为α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。(四)Wnt/β-连环蛋白信号通路在Mch诱导人ASMC表达ECM蛋白中的作用1.细胞准备:将细胞接种于35mm/60mm培养皿中,待细胞生长至占培养皿底面积70～80%时,收集细胞,用于提取总RNA或总蛋白。2.检测总β-连环蛋白表达水平:以0.1ng/ml～10ng/ml浓度的Mch作用于细胞24h,检测总β-连环蛋白表达水平;用接种于60mm培养皿中的细胞提取细胞总蛋白,Western Blot检测总β-连环蛋白表达水平,以β-actin作为内参,计算总β-连环蛋白与β-actin条带灰度值之比表示总β-连环蛋白表达水平。3.检测磷酸化糖原合酶激酶3β(P-GSK3β)表达水平:以最佳浓度的Mch作用于细胞0～2h,检测糖原合酶激酶3(α+β)及P-GSK3β的蛋白表达水平;用接种于60mm培养皿中的细胞提取细胞总蛋白,Western Blot检测P-GSK3β表达水平,以GSK3(α+β)作为内参,计算总P-GSK3β与GSK3(α+β)条带灰度值之比表示P-GSK3β表达水平。4.检测非磷酸化(活化)的β-连环蛋白表达水平:以最佳浓度的Mch作用于细胞0～48h,检测非磷酸化β-连环蛋白表达水平;用接种于60mm培养皿中的细胞提取细胞总蛋白,Western Blot检测非磷酸化β-连环蛋白表达水平,以β-actin作为内参,计算非磷酸化β-连环蛋白与β-actin条带灰度值之比表示非磷酸化β-连环蛋白表达水平。5.分组:细胞随机分为对照组、Mch组、PKF115-584组、(Mch+PKF115-584)组。6.检测胶原蛋白Ⅰα1的蛋白表达水平:用接种于60mm培养皿中的细胞提取细胞总蛋白,Western Blot检测各组胶原蛋白Ⅰ α1表达水平,以GAPDH作为内参,计算胶原蛋白Ⅰ α1与GAPDH条带灰度值之比表示胶原蛋白Ⅰ α1蛋白表达水平。7.检测不同ECM蛋白mRNA表达:用接种于35mm培养皿中的细胞提取细胞总RNA,并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR对胶原蛋白Ⅰ α1、纤连蛋白、多功能蛋白聚糖特异性片段进行扩增,读取各组CT值,计算2-△△CT值表示ECM蛋白mRNA相对表达量。8.统计分析:所有数据均为计量资料,数值均以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件,进行多组间总体均数比较,若方差齐采用单因素方差分析(one-way ANOVA),若方差不齐采用Welch校正检验。多重比较时,方差齐时采用LSD法检验,方差不齐时采用Dunnett’s T3法检验。检验水准为α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。四、结果(一)人气道平滑肌细胞原代培养及鉴定1.约2～3周后,光镜下观察可见平滑肌组织块周围陆续有短梭形的细胞爬出,细胞贴壁生长,之后逐渐变为长梭形,卵圆形胞核位于细胞中央,可见1个或多个核仁。2.细胞继续生长1周左右,相邻组织块周围的细胞开始发生融合,传代24h后观察,细胞贴壁良好,3～4天后可生长融合,排列规律呈典型的“峰谷”征。3.细胞免疫荧光染色大约95%的细胞α-SMA表达阳性,鉴定为平滑肌细胞。4.以1 x104/cm2接种于培养皿,3天后可达到培养皿底面积70～80%。(二)Mch对人ASMC细胞外基质蛋白表达的作用1.浓度梯度实验显示:对照组,0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml浓度组,胶原蛋白 Ⅰα1 的蛋白灰度值分别为:0.255±0.009、0.383±0.006、0.4123±0.012、0.401±0.004;与对照组相比,0.1ng/ml～10ng/ml浓度的Mch均能引起胶原蛋白Ⅰ α1的蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.001),其中1ng/ml最为明显。2.时间梯度实验显示:对照组、2h、4h、6h、16h、24h、48h组,胶原蛋白Ⅰ α1 的蛋白灰度值分别为:0.372±0.090、0.512±0.070、0.537±0.010、0.529±0.011、0.550±0.015、0.561±0.002、0.443±0.066;与对照组相比,Mch 刺激 2～48h 均能引起胶原蛋白Ⅰα1的蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.001),其中刺激24h表达量最高。3.ECM蛋白mRNA的表达:Mch(1ng/ml)刺激细胞24h后,对照组、胶原蛋白Ⅰ α1、纤连蛋白、多功能蛋白聚糖、层粘连蛋白α2、核心蛋白多糖mRNA相对表达水平分别为:1.000±0.010、2.540±0.177、1.780±0.125、2.343±0.190、1.357±0.068、0.743±0.103;与对照组相比,胶原蛋白Ⅰα1(P<0.001)、纤连蛋白(P<0.001)、多功能蛋白聚糖(P<0.001)、层粘连蛋白α2(P<0.01)mRNA表达均有所增加,而核心蛋白多糖mRNA表达减少(P<0.05)。(三)噻托溴铵对Mch诱导人气道平滑肌细胞ECM蛋白表达的抑制作用1.胶原蛋白Ⅰ α1的蛋白表达:对照组、Mch组、Tiotropium组和(Mch+Tiotropium)组胶原蛋白Ⅰα1的蛋白表达量分别为:0.135±0.038、0.308±0.039、0.157±0.044、0.146±0.048;与对照组相比,Mch组胶原蛋白 Ⅰα1高表达,差异有统计学意义(P<0.001);(Mch+Tiotropium)组与Mch组相比,胶原蛋白Ⅰα1表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。2.不同ECM蛋白mRNA表达:(1)胶原蛋白Ⅰ α1 mRNA的表达:对照组、Mch组、Tiotropium组和(Mch+Tiotropium)组胶原蛋白Ⅰ α1 mRNA的相对表达量分别为:1.000±0.305、2.520±0.375、1.220±0.195、1.333±0.215;与对照组相比,Mch 组胶原蛋白 Ⅰα1 mRNA高表达,差异有统计学意义(P<0.001);(Mch+Tiotropium)组与Mch组相比,胶原蛋白Ⅰα1表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.001)。(2)纤连蛋白mRNA的表达:对照组、Mch组、Tiotropium组和(Mch+Tiotropium)组纤连蛋白mRNA的相对表达量分别为:1.000±0.215、2.157±0.281、1.193±0.146、1.270±0.191;与对照组相比,Mch组纤连蛋白 mRNA高表达,差异有统计学意义(P<0.001);(Mch+Tiotropium)组与Mch组相比,纤连蛋白mRNA表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.001)。(3)多功能蛋白聚糖mRNA的表达:对照组、Mch组、Tiotropium组和(Mch+Tiotropium)组多功能蛋白聚糖mRNA的相对表达量分别为:1.000±0.213、2.240±0.305、1.230±0.178、1.277±0.260;与对照组相比,Mch 组多功能蛋白聚糖mRNA高表达,差异有统计学意义(P<0.001);(Mch+Tiotropium)组与Mch组相比,多功能蛋白聚糖mRNA表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。(四)Wnt/β-连环蛋白信号通路在Mch诱导人ASMC表达ECM蛋白中的作用1.总β-连环蛋白表达:对照组、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml浓度组,总β-连环蛋白的蛋白灰度值分别为:0.229±0.044、0.357±0.051、0.385±0.065、0.352±0.065;与对照组相比,0.1ng/ml～10ng/ml浓度的Mch均能引起细胞总β-连环蛋白的表达增加,差异有统计学意义(P<0.05),其中1ng/ml最为明显。2.磷酸化糖原合酶激酶3β(P-GSK3β)表达:对照组、5min、15min、30min、60min、120min组,P-GSK3β 的蛋白灰度值分别为:0.729±0.112、1.138±0.111、1.157±0.117、1.188±0.109、1.233±0.140、1.380±0.075;与对照组相比,Mch刺激细胞5～120 min均能引起GSK3β蛋白磷酸化,差异有统计学意义(分别为P<0.01,P<0.01,P<0.001,P<0.001,P<0.001),其中 120min 最为明显。3.非磷酸化(活化)的β-连环蛋白表达:对照组、2h、4h、6h、16h、24h、48h组非磷酸化的β-连环蛋白灰度值分别为:0.279±0.061、0.307±0.044、0.318±0.024、0.365±0.053、0.442±0.053、0.457±0.476、0.418±0.030;与对照组相比,Mch刺激6～48h均能引起非磷酸化的β-连环蛋白表达增加,差异有统计学意义(分别为P<0.05,P<0.01,P<0.001,P<0.01),其中刺激24h表达量最高。4.胶原蛋白Ⅰ α1的蛋白表达:对照组、Mch组、PKF115-584组、(Mch+PKF115-584)组胶原蛋白 Ⅰα1 蛋白灰度值分别为:0.551±0.057、0.775±0.075、0.573±0.063、0.614±0.111;与对照组相比,Mch能引起胶原蛋白Ⅰ α1表达增加,差异有统计学意义(P<0.01),(Mch+PKF115-584)组与Mch组相比,胶原蛋白Ⅰ α1表达量明显减少,差异有统计学意义(P<0.01)。5.不同ECM蛋白mRNA表达:(1)胶原蛋白Ⅰ α1 mRNA的表达:对照组、Mch组、PKF115-584组、(Mch+PKF115-584)组胶原蛋白Ⅰα1 mRNA的相对表达量分别为:1.000±0.105、2.453±0.228、1.153±0.146、1.367±0.166;与对照组相比,Mch 能引起胶原蛋白Ⅰ α1 mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.001),(Mch+PKF115-584)组与Mch组相比,胶原蛋白Ⅰα1 mRNA表达量明显减少,差异有统计学意义(P<0.001)。(2)纤连蛋白mRNA的表达:对照组、Mch组、PKF115-584组、(Mch+PKF115-584)组纤连蛋白mRNA的相对表达量分别为:1.000±0.105、2.157±0.181、1.193±0.143、1.257±0.160;与对照组相比,Mch能引起纤连蛋白mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.001),(Mch+PKF115-584)组与Mch组相比,纤连蛋白mRNA表达量明显减少,差异有统计学意义(P<0.001)。(3)多功能蛋白聚糖mRNA的表达:对照组、Mch组、PKF115-584组、(Mch+PKF115-584)组多功能蛋白聚糖mRNA的相对表达量分别为:1.000±0.305、2.273±0.256、1.200±0.122、1.307±0.215;与对照组相比,Mch 能引起多功能蛋白聚糖mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.001),(Mch+PKF115-584)组与Mch组相比,多功能蛋白聚糖mRNA表达量明显减少,差异有统计学意义(P<0.001)。五、结论1.组织块贴壁法培养人ASMC的周期约为1个月;细胞以1 ×104/cm2传代和接种于培养皿较为合适;细胞经平滑肌特异的α-SMA免疫荧光染色鉴定,细胞纯度可达约95%。2.Mch可以引起人气道平滑肌细胞ECM蛋白表达增加,最适刺激浓度为1ng/ml,最佳刺激时间为24h。3.噻托溴铵对Mch诱导的人气道平滑肌细胞ECM蛋白表达具有抑制作用。4.Wnt/β-连环蛋白信号通路在Mch诱导人ASMC表达ECM蛋白中发挥重要的调控作用。