目的:1,2-二氯乙烷(1,2-Dichloroethane,1,2-DCE)是一种卤代烃类化合物,主要用于合成氯乙烯单体,也可作为粘合剂、脱脂剂和清洗剂等的有机溶剂。1,2-DCE属高毒物质,具有脂溶性,在生产环境中主要经呼吸道吸入并快速分布于全身各器官组织,其中脑组织为其蓄积和损害的主要靶器官。近年来,该类中毒事故发病趋势有所上升,然而,迄今有关1,2-DCE中毒性脑水肿机制的研究资料仍很缺乏,亟待进行深入研究。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)表达异常在血管源性脑水肿的形成和发展过程中具有关键作用。其中MMP-9是脑组织中最重要的基质金属蛋白酶,能降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和血管基底膜。我们的前期研究结果表明,脑组织中MMP-9过表达的改变发生在小鼠亚急性1,2-DCE中毒性脑水肿形成过程的早期。由于血管基底膜和ECM是维持血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)完整性的重要结构基础,与BBB的通透性密切相关,所以过表达的MMP-9可破坏BBB的完整性并使其通透性增高,进而促发血管源性脑水肿。此外,有研究认为MMP-9表达增加还可降解紧密连接蛋白(tight junction proteins,TJs),进一步破坏BBB完整性。另外,p38 MAPK(Mitogen-activated portein kinase,MAPK)信号通路可以激活MMP-9的基因启动子上存在的核转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)结合位点,NF-κB的活化能够正向调节MMP-9的表达。另一方面,炎症反应与脑水肿的形成和发生发展密切相关。p38 MAPK和NF-κB被认为是炎症发生发展过程中重要的信号通路。激活的p38 MAPK/NF-κB信号通路除了能够上调炎症因子MMP-9蛋白表达,还可增加炎症因子血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1),细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表达。细胞黏附分子VCAM-1和ICAM-1还可将外周循环单核细胞粘附并使其透过BBB转移至脑组织内,进一步加重BBB破坏和扩大炎症反应发生。同时,炎症反应发生与胶质细胞活化密切相关:星形胶质细胞参与中枢神经系统内主要的生理过程,如血脑屏障和细胞间通讯的功能;小胶质细胞的促炎性活化能够通过降低炎症反应而减轻脑水肿的发生。此外,p38 MAPK信号通路还可促进炎症细胞因子IL-1β的表达,炎症反应或细胞应激诱导的IL-1β能进一步激活p38 MAPK信号通路,扩大炎症反应的发生。本研究在已建立的亚急性1,2-DCE中毒性脑水肿实验动物模型的基础上,探讨p38 MAPK/NF-κB在1,2-二氯乙烷中毒性脑水肿形成过程中对MMP-9的表达调控以及其在炎症反应发生中的作用,并且进一步探索MMP-9对1,2-DCE所致中毒性脑水肿中脑组织TJs的影响以及其伴随的炎症反应在脑水肿形成中的作用,为揭示1,2-DCE中毒性脑水肿的发生机制提供新的研究方向和实验参考数据。研究方法:1、采用静式吸入方式建立亚急性1,2-DCE中毒性脑水肿实验动物模型。选择健康SPF级昆明雌性小鼠,体重20-22克,适应性喂养一周后,按各方案随机分组。小鼠置于100 L静式染毒柜中(5只/柜),以1.2 mg/L 1,2-DCE每天吸入染毒3.5 h,各组小鼠于染毒结束后的次日处死。2、第一部分:小鼠随机分为空白对照组、1,2-DCE染毒1 d、2 d和3 d组,对照组小鼠除不暴露1,2-DCE外,其他处理方式同染毒组。染毒期间观察小鼠中毒症状和体重变化;采用干湿重法测定脑组织含水量;Western Blot法检测p38、磷酸化p38(p-p38)、NF-κB(p65和p50)、磷酸化NF-κB(p-p65)、IκB、磷酸化IκB(p-IκB)、MMP-9和iNOS以及紧密连接蛋白occludin、ZO-1、claudin 5、JAM-1的蛋白表达水平;Real-time RT-PCR法检测p38、p65、p50、IκB和MMP-9 mRNA表达水平;HE染色进行脑组织病理观察;荧光素钠法测定BBB通透性;ELISA法检测脑组织中IL-1β含量。3、第二部分:(一)p38抑制剂的干预模型:小鼠随机分为空白对照组、溶剂对照组、p38 MAPK抑制剂对照组、1,2-DCE单纯染毒组、低、中和高剂量p38 MAPK抑制剂组,除对照组小鼠外其余各组分别染毒3 d。低、中和高剂量p38 MAPK抑制剂组小鼠分别在染毒前腹腔注射3.75 mg/kg、7.5 mg/kg和15 mg/kg的p38 MAPK抑制剂(SB202190)200μL;p38 MAPK抑制剂对照组注射相同体积的p38 MAPK(15mg/kg)抑制剂;溶剂对照组和1,2-DCE单纯染毒组腹腔注射相同体积的DMSO;空白对照组腹腔注射相同体积的生理盐水。脑组织检测指标如下:脑含水量;p38、p-p38、p65、p50、p-p65、IκB、p-IκB、MMP-9和iNOS以及TJs的蛋白表达水平;p38、p65、p50、IκB和MMP-9 mRNA表达水平;病理观察;EMSA法检测核转录因子NF-κB的DNA结合活性;IL-1β含量。相应方法同前,后同。(二)NF-κB抑制剂的干预模型:小鼠随机分为对照组、1,2-DCE单纯染毒组、低和高剂量NF-κB抑制剂,除对照组外分别染毒3 d。低、高剂量NF-κB抑制剂组分别在染毒前腹腔注射10 mg/kg、100 mg/kg的NF-κB抑制剂PDTC 200μL;对照组和1,2-DCE单纯染毒组腹腔注射相同体积的生理盐水。脑组织检测指标如下:脑含水量;MMP-9、TJs、iNOS和IL-1β的蛋白表达水平;MMP-9基因表达水平;病理观察;NF-κB的DNA结合活性。(三)MMP-9抑制剂的干预模型:小鼠随机分为对照组、1,2-DCE单纯染毒组、低和高剂量MMP-9抑制剂组,除对照组外分别染毒3 d。低、高剂量MMP-9抑制剂组小鼠分别在染毒前腹腔注射12.5 mg/kg、25 mg/kg的MMP-9抑制剂(SB-3CT)200μL;对照组和1,2-DCE单纯染毒组小鼠腹腔注射相同体积的溶剂。检测脑含水量的变化和TJs的蛋白表达水平。4、第三部分:(一)NF-κB抑制剂和p38抑制剂干预模型:分组和干预同前。p38抑制剂干预模型检测脑组织中p-p65、GFAP、Iba-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白表达水平。NF-κB抑制剂干预模型检测脑组织中GFAP、Iba-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白表达水平;ICAM-1和VCAM-1基因表达水平;免疫组织化学染色法观察脑组织中Iba-1和VCAM-1的表达情况、免疫荧光染色方法观察ICAM-1单染和VCAM-1与GFAP双染情况。(二)IL-1β受体抑制剂的干预模型:小鼠随机分为对照组、抑制剂对照组、1,2-DCE单纯染毒组、低和高剂量IL-1β受体抑制剂组。除了对照组小鼠以外,其他各组小鼠分别染毒3 d。低、高剂量IL-1β受体抑制剂组和抑制剂对照组小鼠分别在染毒前侧脑室注射2μg、4μg的IL-1β受体抑制剂IL-1ra 4μL;对照组和1,2-DCE单纯染毒组小鼠腹腔注射相同体积的生理盐水。检测脑组织中ICAM-1、VCAM-1、GFAP、Iba-1、p-p38、p-p65、p-IκB、iNOS和IL-1β的蛋白含量以及IL-1β基因表达水平。结果:1、在第一部分中,染毒3 d组小鼠出现典型的脑中毒损伤性行为学表现并且体重减轻,小鼠脑组织含水量和BBB通透性检测均从染毒第2天开始显著增高(P<0.05)。HE染色病理观察可见典型脑水肿病理改变:大脑皮质神经细胞胞体肿胀变性且边缘模糊、胞浆淡染、核周腔隙增宽,部分血管管周间质疏松。染毒2 d和3 d组小鼠脑组织中MMP-9和IL-1β蛋白和基因表达显著高于对照组(P<0.05);而p-p38/p38比值从染毒1 d组即显著高于对照组。染毒2 d和3d组小鼠脑组织中p65、p-p65和p-IκB蛋白表达水平显著高于对照组,与之相反,IκB的蛋白表达水平显著低于对照组;与对照组相比,染毒2 d和3 d组p65以及染毒3 d组IκB的mRNA表达水平均显著上升(P<0.05)。p38和p50蛋白和mRNA表达水平与对照组相比均无统计学差异。紧密连接蛋白occludin、ZO-1、claudin 5的蛋白表达均随染毒天数的增加而下降,而JAM-1在染毒3 d组表达显著上升(P<0.05)。iNOS蛋白表达从第2d开始随染毒天数的增加而下降(P<0.05)。2、在第二部分中,p38MAPK抑制剂预处理能够显著改善1,2-DCE中毒小鼠的体重下降和脑组织含水量升高。与单纯染毒组相比,各p38抑制剂组p-p38/p38蛋白比值均显著降低,中、高剂量p38抑制剂组MMP-9 mRNA表达水平和高剂量p38抑制剂组MMP-9蛋白表达水平也随之显著降低(P<0.05)。与染毒组相比,低和高剂量p38抑制剂组小鼠脑组织中p-p65蛋白、p65和IκB的mRNA表达水平均显著下降,p-IκB蛋白表达水平剂量依赖性下降、IκB蛋白表达水平显著上升(P<0.05)。此外,NF-κB抑制剂的干预也能有效改善1,2-DCE暴露小鼠脑组织含水量和预防其体重下降,下调过表达MMP-9,减少TJs蛋白损失(P<0.05)。MMP-9抑制剂SB-3CT干预后,干预组中TJs蛋白表达较染毒组上升,同时脑含水量降低(P<0.05)。NF-κB抑制剂和p38抑制剂均能显著降低单纯染毒组小鼠脑组织中过表达的iNOS和IL-1β。3、在第三部分中,与对照组相比,各模型染毒组小鼠脑组织中小胶质细胞和星形胶质细胞的激活标志物Iba-1和GFAP、炎症因子VCAM-1和ICAM-1的表达均显著增加(P<0.05)。p38抑制剂干预不仅能不同程度的显著抑制1,2-DCE中毒小鼠脑组织中上调的Iba-1和GFAP,还能下调其中过表达的VCAM-1和ICAM-1(P<0.05)。此外,NF-κB抑制剂干预也能不同程度的显著降低上调1,2-DCE中毒小鼠脑组织中Iba-1和GFAP和下调过表达的VCAM-1和ICAM-1(P<0.05)。GFAP与Iba-1免疫染色结果与其蛋白检测结果基本一致,NF-κB抑制剂干预可显著减少中毒小鼠脑组织中星形胶质细胞和小胶质细胞的激活。VCAM-1和ICAM-1免疫染色结果亦与其蛋白表达结果一致,其中染毒组小鼠脑组织中ICAM-1免疫荧光染色可见ICAM-1阳性血管数量增多。与对照组相比,高剂量IL-1ra受体抑制剂干预组小鼠脑组织中p-p38/p-38、p-p65、p-IκB和VCAM-1、ICAM-1以及Iba-1蛋白表达水平、IL-1β蛋白与mRNA表达水平均显著降低(P<0.05);iNOS和GFAP的蛋白表达水平不受IL-1ra受体抑制剂干预的影响。结论:1.亚急性1,2-DCE诱导的小鼠脑水肿中,小鼠脑组织p38 MAPK和NF-κB信号通路被激活,且p38 MAPK信号通路的激活是脑水肿形成过程中的早期事件,与此同时伴随MMP-9表达上调和紧密连接蛋白表达量减少以及BBB通透性破坏。2.p38 MAPK通过激活NF-κB信号通路转录水平上增加MMP-9的表达,进而降解TJs,破坏BBB完整性。3.亚急性1,2-DCE所致中毒性脑水肿的同时伴有炎症反应的发生,并主要由p38 MAPK和NF-κB信号通路调控炎症因子的表达。在1,2-DCE中毒小鼠脑水肿形成过程中,由于p-p38的蛋白改变早于IL-1β,因此IL-1β不是炎症发生的主要始动因素,但具有部分的炎症放大作用。