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背景和目的:缺血性脑卒中发生后,作为一种重要的抗炎和免疫调节细胞因子,白细胞介素10(IL-10,interleukin-10)能够发挥强大的神经保护作用。IL-10的这一作用在大量的由大脑中动脉闭塞(MCAO,middle cerebral artery occlusion)模拟的体内脑缺血模型及由原代皮层神经元缺氧缺糖(OGD,Oxygen-glucose deprivation)培养模拟的体外脑缺血研究中都得到了验证。然而,IL-10能否促进OGD损伤后神经突起生长及突触形成仍然是未知的,值得进一步研究。本研究通过对大鼠原代皮层神经元缺氧缺糖(OGD)处理建立体外脑缺血模型,并在此基础上,观察外源性IL-10对缺氧缺糖损伤的原代皮层神经元凋亡、突起生长和突触形成的影响,并寻找其可能机制。本研究为进一步拓展我们对IL-10在缺血性脑血管病中的神经保护作用机制及其临床应用提供更多理论依据。方法:1.大鼠原代皮层神经元的分离、培养及鉴定。2.取培养第7天的大鼠皮层神经元进行90分钟OGD处理,建立体外脑缺血模型;分别通过光镜和激光共聚焦显微镜观察OGD后皮层神经元细胞损伤情况;检测OGD损伤后皮层神经元白细胞介素10受体1(IL-10R1)的表达变化情况。3.大鼠原代皮层神经元OGD损伤前后,添加外源性IL-10、白细胞介素10中和抗体(IL-10NA,IL-10 neutralizing antibody)或JAK1特异性抑制剂GLPG0634。实验随机分为以下五组:正常对照组(Control组)、OGD模型组(OGD组)、OGD+IL-10组、OGD+IL-10+JAK1特异性抑制剂组(OGD+IL-10+GLPG0634组)、OGD+IL-10中和抗体组(OGD+IL-10NA组)。4.各组皮层神经元细胞在药物干预后进行如下检测:q PCR技术检测各实验组IL-10R1、Bax、Bcl-2、Netrin-1(神经突起生长导向因子)、synaptophysin(突触素)及GAPDH的表达情况;western blot检测各实验组IL-10R1、JAK1、p JAK1、STAT3、p STAT3、Bax、Bcl-2、Netrin-1、synaptophysin及GAPDH的表达量;Annexin-v/PI染色结合流式细胞仪技术检测神经元凋亡情况;各实验组皮层神经元进行免疫荧光染色,随后立即用ZEISS LSM 780激光共聚焦显微镜拍照,应用LSM Image Browser(V4.2.0.121)软件测量神经元最长神经突起长度并计数一级神经突起数量;应用Image J软件测算神经元树突棘、兴奋性突触及抑制性突触的密度。5.为了确定Netrin-1在IL-10促进OGD损伤后大鼠皮层神经元突起生长中的作用,Netrin-1 sh RNA被加入到培养第五天的皮层神经元细胞培养液里,并以无目标的杂乱序列sh RNA(Scrambled sh RNA)作为空白对照组。48小时后,皮层神经元进行90分钟OGD处理。在OGD前后,IL-10或IL-10NA被加入到皮层神经元中。按随机原则进行实验分组,具体如下:Control组、OGD组、OGD+Scrambled sh RNA组、OGD+Netrin-1 sh RNA组、OGD+Netrin-1 sh RNA+IL-10组、OGD+Scrambled sh RNA组+IL-10组。各组皮层神经元进行免疫荧光染色,拍照、测量最长神经突起长度及计数一级神经突起数量的方法如上。结果:1.OGD培养后的神经元细胞出现轴突断裂、缩短,甚至缺失,部分细胞核出现固缩、碎裂或溶解。2.IL-10R1检测结果:相对于Control组,OGD组IL-10R1 m RNA水平和蛋白水平的表达都有明显提高。3.IL-10能够激活大鼠皮层神经元细胞OGD后JAK1/STST3信号通路。4.IL-10可通过下调促凋亡蛋白Bax表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达抑制OGD损伤后皮层神经元的凋亡;而当加入JAK1特异性抑制剂GLPG0634后,IL-10的抗凋亡作用减弱;此外,IL-10NA能够通过增加Bax表达,减少Bcl-2表达促进OGD损伤后皮层神经元凋亡。5.IL-10能够提高OGD后大鼠皮层神经元平均最长神经突起长度、平均一级神经突起数量及Netrin-1的表达;而IL-10的这一作用可被GLPG0634部分抑制;与IL-10的作用相反,IL-10NA可降低OGD后大鼠皮层神经元平均最长神经突起长度、平均一级神经突起数量及Netrin-1的表达。而Netrin-1基因干扰在降低OGD后大鼠皮层神经元平均最长神经突起长度、平均一级神经突起数量的同时,可明显抑制IL-10提高OGD后平均最长神经突起长度、平均一级神经突起数量的作用。6.IL-10能够增加OGD后大鼠皮层神经元synaptophysin的表达及树突棘、兴奋性突触和抑制性突触的密度;GLPG0634部分抑制IL-10的这一作用;与GLPG0634的作用相似,IL-10NA减少OGD后皮层神经元synaptophysin的表达及树突棘、兴奋性突触和抑制性突触的密度。结论:1.OGD能提高大鼠原代皮层神经元细胞IL-10R1的表达。2.IL-10通过激活JAK1/STAT3信号通路下调Bax表达,上调Bcl-2表达抑制OGD损伤后大鼠皮层神经元细胞凋亡。3.IL-10通过介导JAK1/STAT3/Netrin-1信号通路促进OGD损伤后大鼠皮层神经元突起生长。4.IL-10通过激活JAK1/STAT3信号通路上调synaptophysin表达促进OGD损伤后大鼠皮层神经元突触形成。