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牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染引起的一种以腹泻、急/慢性黏膜炎、繁殖障碍、持续性感染和免疫耐受为特征的传染病。BVDV为单股正链RNA病毒,它与猪瘟病毒、羊边界病病毒同属于黄病毒科瘟病毒属。该病毒具有广泛的宿主嗜性,除了感染牛,还可感染猪、羊、鹿、骆驼及其它多种动物并引起发病,使其在自然界中难以清除,给整个牲畜养殖业造成巨大的危害。BVDV感染怀孕母畜常引起免疫耐受,导致持续性感染(Persistent infection,PI)牛的产生。PI牛对疫苗免疫不产生相应的抗体,病毒得以在体内持续存在并不断向外排毒感染其它牛群,这使得PI牛成为BVD感染中最主要的传染源。现有的防控策略很难将BVDV从牛群中根除,因此,我们亟需寻找一种新的抗病毒方案以有效防控BVDV的感染。近期研究发现,血红素加氧酶1(Heme oxygenase-1,HO-1)作为细胞中的一种重要的抗氧化应激蛋白,不仅具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种生物学功能,而且在病毒感染中也发挥着非常重要的调控作用。乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒感染可以抑制HO-1的表达,上调HO-1表达可有效抑制这些病毒的感染。但是猪瘟病毒感染却可促进HO-1的表达,降低HO-1的表达反而抑制了该病毒的感染,这说明不同病毒的感染,HO-1所发挥的作用并不相同。BVDV感染能否调控细胞中HO-1的表达?HO-1在BVDV感染细胞的过程中发挥什么作用?这一切都尚未清楚。因此本研究拟明确BVDV感染对宿主细胞HO-1表达的影响,进一步阐明HO-1在BVDV感染细胞过程中的作用,主要研究结果如下:1.BVDV感染降低MDBK细胞中HO-1的表达水平我们首先检测了BVDV感染后不同时间点MDBK细胞中BVDV、HO-1、HO-2、NQO1(NAD(P)H醌氧化还原酶1,与HO-1同属于抗氧化反应元件所调控)mRNA和蛋白的表达情况。结果表明,BVDV感染后MDBK细胞中HO-1及NQO1的表达水平显著下降,且下降的趋势与病毒感染时间呈正相关,而HO-2的表达无显著变化。这说明BVDV感染可抑制MDBK细胞中HO-1表达,其抑制作用初步证实与抗氧化通路相关,而HO-2的表达不受影响。2.上调HO-1表达显著抑制BVDV的感染为了研究HO-1在BVDV感染过程中的作用,我们首先应用HO-1的诱导剂CoPP处理MBDK细胞,然后检测CoPP诱导HO-1对BVDV复制的影响。结果表明,CoPP诱导显著上调了细胞中HO-1的表达而HO-2表达水平没有变化,并且细胞的活性不受影响。CoPP呈浓度梯度依赖性的降低BVDV mRNA和蛋白的表达水平及病毒滴度,而且不论病毒感染前或感染后用CoPP处理MDBK细胞,均可显著降低BVDV的复制。该结果表明,CoPP诱导HO-1上调表达可有效抑制BVDV的感染。为证明CoPP对BVDV感染的抑制作用是由HO-1介导的,我们构建了可表达HO-1的重组腺病毒,利用该病毒感染MDBK细胞,在细胞中特异性过表达HO-1,研究其对BVDV感染的影响。结果表明,感染重组腺病毒的细胞中HO-1的表达水平显著升高,而BVDV的NS5B蛋白含量及细胞上清中病毒RNA的含量和病毒滴度均呈显著降低。该结果证实了特异性上调HO-1的表达可有效抑制细胞中BVDV的感染。3.特异性降低HO-1基础表达水平促进BVDV的感染由于诱导或过表达HO-1均显著降低了BVDV的感染,我们想进一步了解降低细胞中HO-1的基础表达水平能否影响BVDV的复制。因此我们将特异性干扰HO-1表达的siRNA转入MDBK细胞以降低细胞中HO-1的基础表达水平,然后检测HO-1和BVDV mRNA和蛋白表达。结果表明,转染siRNA的细胞HO-1的表达水平显著降低,而细胞上清中病毒RNA的含量及病毒滴度却显著升高。说明特异性降低HO-1的基础表达水平可促进BVDV的感染。4.CoPP通过HO-1介导抑制BVDV的复制为了证明CoPP处理对BVDV感染的抑制作用是由HO-1特异性介导的,转染siRNA的MDBK细胞,接毒后用CoPP处理,然后检测BVDV的病毒滴度和蛋白表达情况。结果表明,转染siRNA可部分逆转CoPP诱导对BVDV感染的抑制作用,该结果证明CoPP是通过HO-1的介导抑制BVDV的复制。5.HO-1抑制BVDV复制的作用与其代谢产物有关为进一步了解HO-1抑制BVDV感染的原因,我们采用biliverdin、CORM-2及FeCl3(模拟HO-1的代谢产物biliverdin,CO和Fe2+)分别处理细胞,然后检测BVDV的感染情况。结果表明,采用biliverdin和CORM-2处理的细胞,BVDV的感染均显著降低,而采用FeCl3处理的细胞,BVDV感染无显著变化,这初步证明了HO-1抑制BVDV感染的作用与其代谢产物biliverdin和CO有关。综上所述,本研究证明了BVDV感染可以抑制MDBK细胞中HO-1的表达,而上调HO-1表达可显著抑制BVDV的感染,其抑制作用与HO-1的代谢产物biliverdin和CO相关。该研究为阐明BVDV的分子致病机制提供了有用的参考资料,并为抗BVDV感染的研究提供了新的思路及潜在的靶点。