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目的:1.体外实验观察髓磷脂相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)对Neuro-2a细胞神经突起生长的抑制作用及对相关细胞内信号通路Rho A/ROCK的影响。2.观察A型肉毒杆菌神经毒素重链(botulinum neurotoxin serotype-A heavy chain,Bo NT/A HC)对Neuro-2a细胞的促神经突起再生作用并探讨相关的细胞内信号机制。3.探讨Bo NT/A HC是否能够拮抗MAG对神经突起生长的抑制作用。方法:1.采用免疫荧光染色检测Neuro-2a细胞MAG特异性受体NgR的表达,确定外源性MAG可以干预Neuro-2a细胞的必备结构基础。在此基础上,将外源性MAG加入培养液内,于不同时间点收集细胞观察MAG在Neuro-2a细胞中的分布特征以确定NgR的激活。然后在培养液中加入不同浓度的MAG,24 h、48 h、72 h后收集细胞经bIII-tubulin免疫荧光染色后,在荧光倒置显微镜下观察并摄取图像。每个浓度组、每个时间点均设定6个孔,在高倍镜下(40X)每孔随机摄取图片4张,每组共计摄取图片24张,在图片上进行细胞突起长度及有突起细胞占图片上所有细胞的百分比的测定。随后,选择最低有效浓度的MAG作为处理剂量加入细胞培养液,于不同时间点收集全细胞蛋白进行Rho A活性的测定及ROCK磷酸化的检测。2.细胞培养液中加入不同浓度的BoNT/A HC进行干预,按上述方法进行分组设孔,于24 h、48 h、72 h后收集细胞进行bIII-tubulin的免疫荧光染色并摄取图像,对细胞突起长度及有突起细胞占图片上所有细胞的百分比进行计算,确定重链的最佳促神经突起生长作用浓度;随后,以最有效BoNT/A HC浓度作为处理剂量加入细胞培养液,同时,于Bo NT/A HC作用后不同时间点收集全细胞蛋白采用SDS-PAGE/Western-blot检测ERK1/2及Akt的磷酸化改变。3.基于上述,1noml/LBo NT/A HC和20nmol/LMAG为实验剂量,以三种不同方式将其加入细胞培养液:1)加入bont/ahc1h后再加入mag;2)加入mag后1h再加入bont/ahc;3)将mag与bont/ahc同时加入培养液内。分别于上述不同方式加入mag和bont/ahc后24h、48h、72h收集细胞进行biii-tubulin免疫荧光染色以观察细胞突起生长的变化。于此同时,选择同样的处理方式作用于细胞10min、15min、1h、2h收集全细胞蛋白,采用sds-page及western-blot检测rock、erk1/2及akt的磷酸化。结果:1.免疫荧光显示:1)neuro-2a细胞表达ngr;2)外源性给予mag后1h可见neuro-2a细胞内出现mag的强阳性染色,提示外源性mag可以通过与ngr的结合内吞入胞;3)培养液内加入mag使neuro-2a细胞突起生长抑制,表现为突起长度显著低于对照组(p<0.05),有突起细胞占图片上所有细胞的百分比也较对照组减少(p<0.05);4)sds-page/western-blot结果显示:培养液内加入20nmol/lmag后5min、10min、20min,neuro-2a细胞内rhoa活性均较对照组增强,差异有统计学显著性(p<0.05),于此同时,rock的磷酸化也较对照组增强(p<0.05)。2.单纯向培养液内加入不同浓度的bont/ahc时(0.1nmol/l、1nmol/l、10nmol/l),细胞突起的长度及有突起细胞的百分比与对照组相比皆明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05),其中1nmol/l效果最显著;同时,细胞培养液内加入1nmol/l的bont/ahc,分别于15min、30min、60min、90min、2h、3h、4h、5h时检测erk1/2的磷酸化,于15min、30min、60min、120min时检测akt的磷酸化。当bont/ahc作用60min后,erk1/2磷酸化水平较对照组开始增加,差异具有统计学意义(p<0.05);当bont/ahc作用15min和60min时,akt的磷酸化水平增加,与对照组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。3.当以上述三种不同的方式将1nmol/l的bont/ahc和20nmol/l的mag加入neuro-2a细胞培养液后发现:24h、48h、72h后细胞突起长度及有突起细胞百分比与对照组相比差异无统计学显著性(p>0.05);三种处理方式作用于细胞10min、15min后检测rock及akt的磷酸化与对照组比较无显著性差异(p>0.05),作用1h、2h后检测erk1/2的磷酸化也无显著性差异(p>0.05)。结论:1.Neuro-2a细胞表达NgR。外源性给予MAG可激活NgR介导的神经生长抑制信号通路(Rho A-ROCK),抑制神经突起生长。2.小剂量Bo NT/A HC可以促进Neuro-2a细胞突起生长,并可促进再生相关的信号蛋白ERK1/2和Akt的磷酸化。3.Bo NT/A HC可以拮抗MAG引起的神经生长抑制作用。