论文部分内容阅读
中国大鲵(Andrias davidianus)是我国珍稀的名贵特产,也是目前世界上个体最大的两栖类动物。由于大鲵属于野生动物从水生向陆生过渡的物种,因此在研究物种起源、进化、生物多样性、基因变异等方面具有重要的科学意义。不仅如此,大鲵还具有丰富的营养价值和药用价值。近年来,随着我国大鲵养殖规模的不断扩大,大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus)所引起的病毒性疾病给大鲵的养殖业造成了重大经济损失。因而开展大鲵抗病毒防御机制的研究对其病毒性疾病的防控具有重要意义。干扰素(Interferon,IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能的细胞因子。目前除模式生物非洲爪蟾外,其他两栖类动物的Ⅰ型干扰素基因的抗病毒功能鲜有研究。本文克隆与分析了大鲵Ⅰ型干扰素c DNA全长及基因组结构,在细胞水平上验证其抗病毒功能,旨在为研究大鲵免疫防御系统与抗病毒感染机制奠定基础。主要结果如下:1.以中国大鲵肾脏组织总RNA为模板,利用RACE PCR技术克隆得到大鲵Ⅰ型干扰素(gs IFN)c DNA全长,其全长1113 bp,编码186个氨基酸。氨基酸序列分析显示gs IFN序列上具有一个19个氨基酸长度的信号肽序列,在肽链C端发现了高等脊椎动物Ⅰ型干扰素保守的CAWE基序。以大鲵肝脏组织总DNA为模板,采用染色体步移技术扩增得到gs IFN基因全长为5622 bp,其基因组由5个外显子和4个内含子组成。2.实时荧光定量PCR分析结果显示:gs IFN在被检测的组织中均有表达,其中在血液、脾脏和肾脏中表达较高。大鲵外周血白细胞(Peripheral blood leucocytes,PBLs)经终浓度5μg/m L Poly I:C处理4 h后,PBLs中gs IFN表达量开始升高,在处理12 h后,gs IFN表达量达到峰值,为相应对照组的2.8倍。以终浓度25μg/m L Poly I:C处理PBLs 24 h后,gs IFN表达量显著升高,为对照组的3.6倍。用大鲵虹彩病毒(GSIV)诱导刺激PBLs后12 h,gs IFN表达量达到峰值,为相应对照组的13.7倍。实验结果证实Poly I:C和GSIV均能显著上调gs IFN的转录水平,表明gs IFN在抗病毒免疫应答过程发挥了重要作用。3.构建真核表达载体p EGFP-N1-IFN转染大鲵肌肉细胞(GS-M),荧光定量PCR测定结果显示,gs IFN能够诱导干扰素下游Mx基因的表达。同时,体外细胞培养感染实验证实,gs IFN能显著抑制GSIV感染细胞的细胞病变效应(CPE);过表达gs IFN细胞感染GSIV 24 h后,病毒MCP和IE-ICP46基因的表达较对照组分别下调4倍和7倍;在感染48 h后,MCP和IE-ICP46基因的表达分别下调8倍和12倍;过表达gs IFN细胞中病毒滴度降低较对照组低1.5个数量级;间接荧光免疫结果显示,病毒MCP蛋白的合成也受到影响。以上结果表明,gs IFN能够明显抑制GSIV病毒的复制,具有一定的抗病毒功能。