研究背景脓毒症(sepsis),又称全身性感染,是由感染诱发的全身炎症反应综合征,患者机体常常出现对感染的失代偿反应,并进一步出现致命的脏器和系统功能障碍。严重脓毒症(severe sepsis),是指脓毒症病人伴有器官功能的障碍、组织的灌注不良或低血压状态等。严重脓毒症患者病死率高,是危重患者死亡的主要原因之一。因此,及时识别并发现高死亡风险的病人,并能够实施早期干预,对于降低患者病死率非常重要。导致脓毒症患者病情进展和死亡的重要原因之一是组织微循环障碍导致的全身组织低灌注及其后续继发的氧化应激的损伤。组织低灌注及组织细胞缺血缺氧可使得机体产生广泛的活性氧以及活性氮,导致细胞中的线粒体功能障碍,并进一步损伤细胞和组织。在脓毒症病人中,缺血缺氧及氧化应激损伤在器官功能障碍的进展中可能发挥了关键作用,并被认为是后续多脏器功能衰竭和死亡发生发展的序曲。鉴于脓毒症的及时诊断及治疗是影响脓毒症患者病死率的重要因素,早期识别上述脓毒症的疾病过程可能有助于及时的临床干预。当组织缺血时,缺血损伤释放的产物改变了血循环中经过损伤部分的部分血清白蛋白的结合位点(位于氨基末端),从而降低了白蛋白与过渡金属离子的结合能力。这种白蛋白继发于组织缺血,而出现与过渡金属离子的结合力变化,因此被称之为“缺血修饰白蛋白”(IMA)。在诊断心肌的缺血时,高水平的血清IMA曾被视为敏感的标记物,但此后的研究发现:IMA水平的升高存在于大部分缺血情况发生(如缺血性脑血管病、肺脏缺血、胃肠道缺血和肌肉组织缺血等)和大量自由基产生的条件下(如肝硬化、肾衰竭和晚期癌症等)。且在急性冠脉综合征、终末期肾病、腹膜透析和结肠切除术前等患者中,血清IMA水平也被证实对患者预后具有评估价值。目前的共识认为:血清IMA是不同临床条件下缺血事件发生和氧化应激状态产生的生物标志物。研究目的已有研究证实,在脓毒症患者中,血清IMA水平可用于量化患者的缺血及氧化应激程度。由于脓毒症的缺血和氧化应激程度往往和患者的预后相关,因此,血清IMA水平也可能是严重脓毒症患者不良预后的生物标志物。然而,血清IMA水平是否对严重脓毒症患者的预后有指示的意义,尚不得而知。在我们的研究中,我们收集入住ICU病房的严重脓毒症患者的相关临床和实验室数据,并试图从以下几个方面探讨问题:1.研究血清IMA水平是否可以预测患者的短期(28天)病死率;2.探讨血清IMA水平预测严重脓毒症患者短期病死率的最佳截断值;3.比较IMA和白蛋白校正后的IMA水平对于短期病死率的诊断效能。研究方法1、研究对象本研究为前瞻观察队列研究。本研究中,我们纳入山东大学齐鲁医院重症监护病房的严重脓毒症住院患者156例,纳入时间范围为2014年4月至2014年10月。严重脓毒症根据“拯救脓毒症运动”国际指南进行定义。患者的排除标准如下:(1)患者存在其他缺血性疾病,如急性冠状动脉综合征、急性缺血性脑血管疾病、急性肺栓塞或急性下肢动脉或静脉栓塞、主动脉夹层等;(2)患者此前存在恶性的心律失常,或者心脏骤停;(3)患者存在未经充分引流的外科感染;(4)患者年龄小于18岁、患有艾滋病或为妊娠状态;(5)患者血清白蛋白水平极低或极高(<20g/L或>55g/L)[31,32];(6)在24h内死亡,或者住院时间<72h,或者放弃进一步治疗的患者。所有患者均参照“拯救脓毒症运动”国际指南的建议接受适当的治疗。记录患者在严重脓毒症发生24h内的一般情况、严重脓毒症原发感染源、实验室结果和基础疾病等数据,对于多部位感染的患者,只记录1个最重要的原发感染源。根据采集的相关数据,计算急性生理与慢性健康状态II(APACHE II)评分和脓毒症相关性器官功能衰竭评分(SOFA)评分等两个危重病患者病情状态的评分。本研究主要的观察终点是病人在28天的病死率。2、检测指标在严重脓毒症发生的早期(24小时内),抽取外周静脉血约5mL。在1620g下离心15分钟,分离血清并且即刻应用IMA测定试剂盒检测患者血清中IMA水平。由于极低的血清白蛋白水平(<20g/L)时,血清IMA的测定水平可能会受到影响,而使用如下校正公式能够消除此影响,校正公式:校正IMA值=(个体血清白蛋白水平/群体的血清白蛋白水平中位数)×所测定IMA值。其中,每组人群中,血清白蛋白的中位数水平分别进行独立的统计。血清IMA水平的高低不影响临床医生的治疗决策或患者的治疗效果。3、统计学分析统计学的分析使用SPSS(版本16.0)。正态分布或者近似正态分布的计量资料,描述形式为x±s,使用独立样本t检验进行组间比较。以百分比来表示计数资料,使用X2检验、或者fisher确切概率法进行计数资料的组间比较。单因素分析所得到的与病死率相关的变量(即P<0.05的变量)纳入到多因素逐步logistic回归分析模型中,以确定与28天死亡相关的独立危险因素,结果表示为比值比(OR)和95%可信区间(95%CI)、P值。使用受试者工作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)评估IMA水平或白蛋白校正的IMA水平对28天病死率的预测价值及相应的灵敏度和特异性,通过ROC曲线来估计最佳截断值(约登指数最大法)。使用Kaplan-Meier生存分析和对数秩检验用于比较28天病死率。P<0.05为差异有统计学意义。结果1、严重脓毒症患者一般情况及感染来源共计117例严重脓毒症患者纳入到该研究,61.5%患者为男性,平均年龄为57.7±18.4岁。患者在发生严重脓毒症后28天时死亡29例,病死率为24.8%。严重脓毒症的两大感染源分别为肺脏和腹/盆腔。2、严重脓毒症患者的血清IMA水平和白蛋白校正血清IMA水平对28天病死率的预测价值我们通过ROC曲线,评估了血清IMA水平和白蛋白校正血清IMA水平对严重脓毒症患者28天病死率的预测价值。血清IMA水平和白蛋白校正血清IMA水平都是28天病死率的有效预测因子,AUC分别为0.742(P<0.001)和0.627(P=0.040),95%CI 分别为 0.638-0.847 和 0.497-0.757。IMA 预测严重脓毒症患者28天病死率的最佳截断值为110U/mL,对应的灵敏度和特异度分别为0.517和 0.886。3、严重脓毒症患者出现死亡的单因素分析和死亡的多因素Logistic回归分析单因素分析发现,与存活组相比,死亡组患者的感染性休克和急性肾损伤发生率、使用有创机械通气和肾脏替代治疗的比例均明显升高(均P<0.01),IMA水平、血糖水平、格拉斯哥昏迷评分、APACHE Ⅱ评分和SOFA评分均明显升高(均P<0.05),白蛋白水平显著降低(P<0.05)。多因素分析发现,与严重脓毒症患者28天病死率相关的独立危险因素仅为血清 IMA 水平(OR,2.104;95%CI,1.032-4.288;P=0.041)和 APACHE Ⅱ评分(OR,1.166;95%CI,1.078-1.261;P<0.001)。血清 IMA 水平和 APACHE Ⅱ评分无统计学相关关系(r=0.064,P=0.495)。4、血清IMA水平不同的严重脓毒症患者的生存分析(Kaplan-Meier法)根据本研究所确定的最佳截断值,我们把血清IMA水平分为3个等级水平:低水平(<10U/mL)、高水平(100-110U/mL)和极高水平(≥110U/mL)。通过Kaplan-Meier生存分析,发现不同血清IMA水平的严重脓毒症患者的28天病死率有显著的统计学差异(P<0.001)。组间比较发现,极高IMA水平患者的28天病死率明显高于低IMA水平及高IMA水平的患者(均P<0.05)。结论1、严重脓毒症的患者血清中IMA水平升高。血清IMA水平能够预测严重脓毒症患者的短期(28天)病死率。通过ROC曲线和多因素Logistic回归分析,我们证实了血清IMA水平不仅是严重脓毒症患者28天病死率的有效预测因子,而且是患者28天死亡的独立危险因素;2、血清IMA水平预测严重脓毒症患者短期(28天)病死率的最佳截断值为110U/ml,通过Kaplan-Meier生存分析进一步证实,血清IMA水平高于110U/ml的患者累计生存率较低。对于血清IMA水平高于110U/ml的严重脓毒症患者,应及时采取积极干预措施,改善患者预后。3、白蛋白校正的IMA水平对于短期病死率的诊断效能并不优于IMA水平,因此,使用白蛋白水平来校正血清IMA水平并非必要。研究背景脓毒症是指由于感染引起的全身炎症反应综合征,可引起组织低灌注、细胞代谢紊乱,严重者导致多脏器功能衰竭甚至死亡。在脓毒症发生时,肝脏是极易受到继发损害的器官。肝脏作为人体最大的器官,具有代谢、解毒、分泌胆汁、免疫防御、凝血等多种重要功能,这些重要的生理功能使肝脏成为脓毒症后宿主存活的关键器官。近期的研究发现,线粒体损伤在脓毒症脏器功能障碍的发生发展中发挥了重要的作用。线粒体作为细胞内的能量转换细胞器,是三磷酸腺苷(ATP)生成的主要场所,为细胞的各种生命活动提供能量。线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)过程由线粒体内膜上的复合体I-IV组成的两条电子传递链进行,此过程中任何环节受损,都可导致ATP生成减少及细胞或器官的代谢紊乱。而针对线粒体损伤进行靶向治疗,可能是一种极有价值的脓毒症早期靶向治疗方式。以下分子调控通路的异常可能是脓毒症患者出现线粒体损伤的主要机制:(1)线粒体生物合成调控通路:线粒体稳定、有效的生物合成对维持其正常形态和功能十分重要,此过程受到过氧化物酶体增殖受体共激活因子1-α(PGC1-α)的调节。PGC1-α是线粒体合成调控的关键因子,其可与核呼吸因子1(NRF1)和NRF2相互作用,促进线粒体转录因子A(TFAM)的表达,促进线粒体DNA的转录、复制和修复;(2)氧化应激调控通路:细胞内超过90%的活性氧族(ROS)是由电子传递链电子漏形成。脓毒症时,线粒体中活性氧族(ROS)、活性氮族(RNS)大量产生,超过机体清除能力,其不仅能直接损伤膜脂、膜蛋白、DNA等大分子,进而启动下游事件的发生,还可与电子传递链部分组分发生反应,可逆或不可逆地抑制线粒体复合体功能,引起线粒体损伤。此过程中会导致更多的氧化应激产物产生,从而形成恶性循环;(3)炎症反应通路:脓毒症发生发展时,会产生并释放大量的促炎介质以及炎症因子,包括白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等,产生线粒体毒性,抑制线粒体氧化磷酸化反应,降低线粒体膜电位和ATP产生,损伤线粒体结构和功能。此外,高迁移率族蛋白1(HMGB1)不仅是重要的炎症调控因子,也是线粒体功能和形态维持的重要调控因子。能对上述调控通路发挥有益作用的干预方式或药物,极有可能发挥线粒体靶向保护作用,改善线粒体损伤,增加线粒体ATP产量,从而有利于减少脓毒症脏器功能障碍的发生发展、降低患者病死率,是脓毒症治疗中较有前途和价值的方式。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1,英文缩写为PARP-1,是一种蛋白修饰酶,活化后的PARP-1能够催化裂解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),生成为烟酰胺和二磷酸腺苷(ADP)核糖,同时将ADP核糖传递至各种各样的靶分子,从而在细胞的多种生理功能的调节中发挥重要而独特的作用。如果PARP-1出现过度活化,会导致细胞水平的NAD+和ATP出现耗竭,使得细胞发生能量供给危机,并导致脏器功能障碍,甚至死亡。PARP-1的活化与一些疾病的发生发展密切相关。多项研究证实,PARP-1会影响多种促炎介质及炎症因子的释放,影响氧化应激反应相关酶类的表达,且PARP-1抑制或敲除后可表现出组织细胞炎症反应减轻、氧化应激损伤减少等有益作用。此外研究表明,PARP-1对组织细胞线粒体功能也具有调控作用。PARP-1激活在脓毒症的发生发展中普遍存在。PARP-1抑制或敲除后产生的上述有益作用提示,PARP-1抑制剂可能对脓毒症诱导的线粒体损伤发挥有益作用。虽然有研究表明,PARP-1抑制或敲除对脓毒症诱导的宏观的血流动力学障碍和脏器功能障碍等发挥了一些潜在的有益作用,但是关于PARP-1抑制后,脓毒症诱导的肝脏线粒体损伤是否受益,以及可能潜在的分子调控机制如何,尚无报道。研究目的1、探讨PARP-1抑制能否改善脓毒症肝脏线粒体损伤;2、研究脓毒症中PARP-1抑制对肝脏线粒体发挥有益作用的潜在分子机制,探讨线粒体生物合成、氧化应激和炎症反应等调控通路在上述机制中的作用。研究方法1、动物实验:采用内毒素(LPS)腹腔注射法建立脓毒症模型。10周龄C57BL/6小鼠称重后,给予腹腔注射LPS 10mg/kg(PBS稀释为2mg/ml浓度)诱导脓毒症动物模型,该组小鼠为脓毒症组(Sepsis,n=10)。对照组小鼠(Control,n=10)则接受腹腔注射同等剂量的PBS。为保证小鼠出现显著的PARP-1抑制及后续效应,PARP-1抑制组(Sepsis+PJ34,n=10)小鼠在脓毒症造模前3h和造模后8h,各腹腔注射一次PARP-1抑制剂PJ34(10mg/kg,生理盐水稀释)。在相同的时间点,对照组以及脓毒症组的动物给予腹腔注射等剂量的生理盐水。脓毒症造模24h后,麻醉动物取材进行后续实验;2、小鼠麻醉后行心脏左心室穿刺取血,检测相关指标:血气分析仪检测血气分析和乳酸水平,商品化试剂盒测定血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平;3、即刻肝脏线粒体复合体呼吸容量测定:取新鲜肝脏组织提取肝脏线粒体后,使用能量代谢测定仪检测即刻线粒体电子传递链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的呼吸容量;4、即刻肝脏线粒体膜电位和线粒体ATP水平:取新鲜肝脏组织提取肝脏线粒体后,使用商品化试剂盒检测即刻肝脏线粒体膜电位和线粒体ATP水平;5、肝脏组织PARP-1活性和NAD+水平检测:使用商品化试剂盒及分光光度法检测肝脏组织PARP-1活性和NAD+水平;6、组织病理学检测:肝脏组织进行HE染色,从而观察肝脏组织的病理变化;7、超微结构观察:通过透射电镜技术,观察肝脏线粒体超微结构的变化;8、酶联免疫吸附测定法(ELISA):使用ELISA试剂盒检测血清中TNF-α、IL-6和HMGB1水平;9、免疫组织化学染色:使用免疫组织化学染色观察PGC1-α和3-硝基酪氨酸(3-NT)修饰蛋白在肝脏组织中的表达情况;10、实时定量逆转录PCR(Realtime RT-PCR)法检测:取小鼠肝脏组织,Trizol法提取RNA,实时定量RT-PCR技术检测PGC1-α、去乙酰化酶1(SIRT1)、TFAM、NRF-1、叉头转录因子O-3a(FOXO-3a)、过氧化氢酶(Catalase)、TNF-α、IL-6和HMGB1 mRNA表达水平;11、Western blot测定:取小鼠肝脏组织,提取蛋白,Western blot检测PGC1-α、NRF-1、超氧化物歧化酶2(SOD2)、4羟基壬烯酸(4-HNE)修饰蛋白、3-NT修饰蛋白和HMGB1的蛋白表达水平。结果一、LPS诱导的脓毒症小鼠模型1、脓毒症组小鼠出现严重的代谢性酸中毒、高乳酸血症、电解质紊乱和肝功能损伤与对照组相比,脓毒症组小鼠出现明显的高乳酸血症、酸中毒、低HCO3-血症、高钾血症、低钙血症及血AST、ALT水平升高(均P<0.05),但血钠水平和血细胞比容等指标并无显著变化(均P>0.05)。对照组小鼠均存活(死亡率0%),脓毒症组小鼠有3只死亡(死亡率30%)。2、脓毒症组小鼠出现明显的肝脏线粒体呼吸容量降低、线粒体ATP水平下降和线粒体膜电位水平下降与对照组相比,脓毒症组的小鼠肝脏线粒体复合体Ⅰ、肝脏线粒体复合体Ⅱ及肝脏线粒体复合体Ⅳ的呼吸容量均显著降低,线粒体ATP水平下降,线粒体膜电位的水平明显降低(均P<0.05)。3、脓毒症组小鼠出现明显的肝脏病理损伤和超微结构异常脓毒症组小鼠肝脏肝小叶结构紊乱,肝细胞肿胀,出现明显气球样变,并可见多量点状坏死和炎细胞浸润。电镜下观察发现,脓毒症组小鼠肝脏存在明显的线粒体肿胀,线粒体嵴等线粒体内部结构显示不清,并出现较多的线粒体自噬现象。4、脓毒症组小鼠肝脏线粒体生物合成上游因子表达水平显著降低与对照组相比,脓毒症组小鼠肝脏组织的PARP-1活性显著增加,NAD+水平明显下降(P<0.05)。与对照组相比,脓毒症组小鼠肝脏组织中SIRT1、PGC1-α及NRF-1等因子的mRNA表达水平均显著下降。在蛋白表达水平,脓毒症组小鼠肝脏组织PGC1-α及NRF-1的蛋白表达水平均明显减低,免疫组化染色显示PGC1-α蛋白主要在胞核中表达,表达量明显减低(均P<0.05)。5、脓毒症组小鼠肝脏出现明显的氧化应激损伤与对照组相比,脓毒症组小鼠肝脏组织过氧化氢酶的mRNA表达水平明显降低,氧化应激调控因子FOXO-3a的mRNA表达水平明显升高,抗氧化酶SOD2的蛋白表达水平明显降低,脂质氧化应激产物(4-HNE修饰蛋白)及氮族氧化应激产物(3-NT修饰蛋白)的表达水平均明显增加;免疫组化染色显示3-NT修饰蛋白主要在胞浆中表达,表达量明显增加(均P<0.05)。6、脓毒症组小鼠肝脏出现明显的炎症反应与对照组相比,脓毒症组小鼠的血清中TNF-α、IL-6和HMGB1等炎性介质水平明显升高(均P<0.05),肝脏组织中TNF-α、IL-6和HMGB1的mRNA表达水平明显升高,HMGB1的蛋白表达水平明显升高(均P<0.05)。二、PARP-1抑制剂PJ-34对脓毒症组小鼠的有益作用1、PARP-1抑制显著减轻脓毒症导致的乳酸酸中毒、高钾血症、低HCO3-血症,并降低AST和ALT水平与脓毒症组相比,PARP-1抑制组小鼠的乳酸产量减少、酸中毒改善,低HCO3-血症及高钾血症显著改善,血AST和ALT水平均明显降低(均P<0.05)。PARP-1抑制组小鼠1只死亡(死亡率10%),较脓毒症组小鼠死亡率(30%)有所下降,但无统计学差异(P>0.05)。2、PARP-1抑制明显改善脓毒症导致的肝脏线粒体损伤与脓毒症组相比,PARP-1抑制组小鼠肝脏线粒体复合体I、肝脏线粒体复合体II及肝脏线粒体复合体IV的呼吸容量均显著升高,线粒体ATP水平和线粒体膜电位水平均明显升高(均P<0.05)。3、PARP-1抑制能够改善脓毒症导致的肝脏线粒体超微结构损伤与脓毒症组相比,PARP-1抑制组小鼠肝脏仍存在肝小叶结构紊乱,肝细胞明显肿胀,并可见点状坏死和炎细胞浸润等表现。但电镜下观察发现肝脏线粒体肿胀现象有所减轻,线粒体嵴显示较前清晰,线粒体自噬现象有所减少。4、PARP-1抑制明显上调肝脏线粒体合成上游调控因子表达水平与脓毒症组小鼠相比,PARP-1抑制组小鼠肝脏PARP-1活性显著降低,NAD+水平明显提升(均P<0.05)。肝脏线粒体生物合成的上游调控因子SIRT1、PGC1-α、NRF-1及TFAM的mRNA表达水平均明显提高,线粒体合成调控因子PGC1-α及NRF-1的蛋白表达水平得到明显提升,免疫组化染色也显示PGC1-α蛋白表达量明显升高(均P<0.05)。5、PARP-1抑制显著减轻脓毒症导致的肝脏氧化应激损伤与脓毒症组小鼠相比,PARP-1抑制组小鼠的的肝脏组织抗氧化酶过氧化氢酶的mRNA表达水平及SOD2蛋白表达水平均明显回升,而FOXO-3a的mRNA表达水平则显著减低,氮族氧化应激产物(3-NT修饰蛋白)表达水平显著下降(均P<0.05),脂质氧化应激产物(4-HNE修饰蛋白)表达水平有降低趋势,但无统计学差异(P>0.05);免疫组化染色显示3-NT修饰蛋白表达量明显减低(P<0.05)。6、PARP-1抑制可减轻脓毒症导致的肝脏炎症反应与脓毒症组小鼠相比,PARP-1抑制组小鼠血清中TNF-α、IL-6和HMGB1水平显著降低,肝脏组织中TNF-α、IL-6和HMGB1的mRNA表达水平明显回落,HMGB1的蛋白表达水平明显降低(均P<0.05)。结论1、LPS诱导的脓毒症小鼠出现明显的肝脏线粒体功能障碍和结构损伤。同时,脓毒症小鼠肝脏线粒体合成上游因子表达水平显著降低,并出现明显的氧化应激损伤和炎症反应。2、PARP-1抑制可以有效缓解脓毒症肝脏线粒体功能障碍和结构损伤,改善线粒体呼吸复合体的呼吸容量,提高线粒体ATP产量,增加线粒体膜电位水平,减少线粒体肿胀和线粒体自噬。3、PARP-1抑制可能通过对肝脏线粒体生物合成通路、氧化应激通路和炎症反应通路的正向调控作用而对线粒体发挥靶向调节作用,从而改善脓毒症继发的肝脏线粒体的损伤。