目的:膀胱肿瘤是世界范围内最常见的肿瘤之一,在所有恶性肿瘤中膀胱癌的发病率居第八位,死亡率居前十位。高达70%的膀胱肿瘤患者最初诊断为非肌层浸润性膀胱癌,25%的膀胱癌患者在诊断之初已有肌层浸润,属浸润性膀胱癌。这类肿瘤在细胞病理分级上多表现为低分化或未分化,常早期发生微转移,即使采取放、化疗等综合治疗手段,预后也较差,浸润性膀胱癌多以手术切除和顺铂为核心的新辅助化疗治疗。虽然以顺铂为核心的新辅助化疗显示了对晚期膀胱癌的良好疗效,但是患者对顺铂产生的耐药造成了其使用的局限性。目前需要攻克的临床难点在于增强膀胱癌患者对顺铂药物的敏感性和减少膀胱癌的复发率。因此,寻找治疗浸润性膀胱癌的有效方法,一直是膀胱癌基础研究领域的重大课题,而对浸润性膀胱癌治疗的研究仍需要从其发生、发展的分子病理基础入手进行多角度的深入探讨。在本研究中原癌基因netrin-1的异常活化是促进膀胱癌肿瘤恶性进展的分子机制之一,可促进肿瘤细胞增殖并且降低顺铂的化疗敏感性。UNC5B是netrin-1依赖性受体之一,具有诱导肿瘤细胞凋亡作用,结果显示:netrin-1/UNC5B在膀胱癌中存在表达并参与癌细胞凋亡。并且miR-214的过表达可以逆转netrin-1造成的肿瘤进展。通过报告基因分析,体外功能实验等方法,力图证实netrin-1/miR-214调控膀胱癌的侵袭转移和耐药的产生。方法:选取人膀胱癌细胞系5637,T24,BIU-87,SV-HUc-1,RT-4和J82,通过细胞培养,收集细胞并提取总RNA和总蛋白,同时收集2008年至2015年在中国医科大学附属第一医院泌尿外科收集手术中切除的膀胱癌及癌旁组织标本,提取总RNA和总蛋白,采用逆转录定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测netrin-1、UNC5B、MiR-214的mRNA表达量,免疫印迹实验(Western-blot)检测netrin-1、UNC5B蛋白的表达量,免疫荧光和免疫组织化学检测netrin-1/UNC5B表达及定位,并分析其与临床病理参数关系,通过摇菌、质粒提取,细胞瞬转和稳转miR-214,细胞增殖实验(CCK-8),克隆形成实验,EdU细胞增殖检测实验,流式细胞仪细胞凋亡检测细胞的增殖和凋亡,从而分析netrin-1、UNC5B、miR-214在膀胱癌细胞系及组织中的表达水平及对膀胱癌细胞的功能作用,进一步证实miR-214通过下调netrin-1促进膀胱癌细胞对顺铂耐药的敏感性。结果:Real time PCR&Western-blot分别从RNA及蛋白水平检测netrin-1/UNC5B的表达,发现UNC5B在癌旁组织中的表达与膀胱癌组织相比明显高并且在低级别膀胱癌组织中的表达高于高级别癌组织,netrin-1则相反。Netrin-1/UNC5B的高/低表达与膀胱癌的临床分期、病理分级及转移相关,同时Pearson相关分析显示netrin-1和UNC5B的表达成负相关。Real time PCR&Western-blot从RNA及蛋白水平检测膀胱癌细胞系(T24、BIU-87、5637和SV)中netrin-1/UNC5B的表达水平,UNC5B在正常膀胱细胞系SV中表达高,而在恶性度高的T24细胞系中表达低,netrin-1则相反。免疫荧光结果显示UNC5B在膀胱癌细胞浆中表达而netrin-1在细胞浆及核中均存在表达。采用RT-qPcR检测30例新鲜膀胱癌组织及相应正常组织miR-214的表达,与正常组织相比,miR-214在癌组织中的表达水平显著下调,miR-214在膀胱癌细胞株中表达下调,抑制细胞增殖和侵袭,用顺铂(10μg/ml)对T24和J82细胞进行CCK-8检测,结果表明miR-214增加膀胱癌细胞对顺铂的化学敏感性,miR-214模拟物转染可将J82和T24细胞系顺铂治疗24小时后的凋亡率显著上调,miR-214的转染模拟下调总caspase-3和总PARP表达,上调裂解的caspase-3和切割的PARP表达。利用Target Scan软件对miR-214的潜在靶点进行预测,结果表明netrin-1是miR-214的靶基因之一,转染miR-214后,netrin-1蛋白和mRNA的表达显著下调。将具有netrin-1野生型(ccU-GcU-G)和突变型(ccU-uu-G)3’-UTR结合位点的报告子与miR-214模拟物一起导入J82细胞,荧光素酶报告物分析表明,miR-214模拟物与对照组相比明显抑制了野生型报告物的荧光素酶强度,以上数据表明,miR-214与netrin-1的3’-UTR结合降低其mRNA和蛋白的表达。与未接受顺铂治疗的细胞相比,顺铂(2和5微克/毫升持续2天)诱导J82和T24细胞的蛋白质表达增加。用5μg/ml顺铂处理的细胞的在mRNA有显著增加。Annexin V/PI分析表明,与对照组相比,netrin-1过表达会明显抑制顺铂诱导的细胞凋亡。Westernblot显示netrin-1基因转染上调AKT磷酸化。结论:miR-214的表达在膀胱癌组织中下调,并与肿瘤分期淋巴结状态和肿瘤分级显著相关。尿中无细胞miR-214水平可作为非肌肉浸润性膀胱癌复发的独立预后指标。miR-214通过下调癌基因PdRG1的表达在膀胱癌中发挥抑癌作用。在本研究中,miR-214在膀胱癌组织和细胞系中的表达水平被下调。miR-214对膀胱癌细胞增殖和侵袭的抑制作用在本研究中也得到了验证。然而,其在膀胱癌细胞抗药性发展中的作用尚待探索。因此,本研究探讨miR-214对J82和T24细胞化疗耐药的影响。结果表明,miR-214模拟物通过上调细胞凋亡率显著降低耐药率。检测一系列凋亡相关蛋白,结果显示,转染miR-214模拟物后,总caspase-3和总PARP表达水平降低,而裂解的caspase-3和裂解的PARP明显上调。这些结果表明miR-214促进细胞凋亡。此外,AKT信号通过上调Bcl-2家族蛋白参与细胞凋亡的调控。因此,miR-214对化疗耐药的影响可能依赖于其对AKT/Bcl-2信号的调节。本研究进一步探讨了miR-214调控细胞凋亡和耐药的机制。利用Target Scan软件预测miR-214的潜在靶基因,确定netrin-1为靶基因之一。netrin-1质粒转染显著下调膀胱癌细胞凋亡,显著上调AKT磷酸化。此外,miR-214可显著降低netrin-1 mRNA和蛋白表达水平。在膀胱癌组织中miR-214和netrin-1的mRNA表达水平呈负相关。此外,荧光素酶报告分析显示miR-214可以直接与netrin-1的3’-UTR结合,这表明netrin-1是miR-214的直接靶点。这些结果共同表明miR-214下调了netrin-1,而netrin-1又反过来抑制pAKT和降低化疗抵抗力。Netrin-1质粒转染修复miR-214下调的顺铂耐药性。综上所述,这些数据表明miR-214通过靶向netrin-1抑制膀胱癌的化疗耐药性。