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随着人口老龄化速度的加快,脑血管疾病已成为造成人类死亡以及永久性残疾的主要原因之一,给家庭和社会带来了严重的经济负担。脑血管疾病中以脑卒中发病率最高,其中缺血性脑卒中占卒中的比例高达80%。恢复血液再灌注是治疗缺血性脑卒中最主要的措施。然而,恢复血液再灌注可导致缺血区脑组织的进一步损伤,这种损伤称为缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。由于脑I/R损伤的发生机制十分复杂,许多研究者将重点放在了脑I/R损伤发生机制的研究上。有研究表明,激动表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)。可减轻脑I/R损伤,但是其作用机制仍有待进一步探究。JAK2/STAT3信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路。随着对JAK2/STAT3信号通路探索的不断深入,越来越多的文献表明,激活JAK2/STAT3信号通路可通过发挥抗炎、抗凋亡、促进血管生成等多种生理学活性发挥抗脑I/R损伤的作用。在抗肿瘤方面的研究表明,激动EGFR可引起JAK2/STAT3信号通路的活化,但是在抗脑I/R损伤的过程中,二者是否依然存在着这种关系,尚未见文献报道。本研究通过在体和离体两部分实验,初步探讨JAK2/STAT3信号通路在激动EGFR抗大鼠脑I/R损伤中的作用及可能的机制,为临床上治疗脑I/R损伤提供新的理论依据。目的:1.探讨激动EGFR在抗脑I/R损伤中与JAK2/STAT3信号通路的关系。2.探讨JAK2/STAT3信号通路在激动EGFR抗大鼠脑I/R损伤中的可能机制。方法:1.体内:采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MACO)模型。为探讨激动EGFR在抗脑I/R损伤中与JAK2/STAT3信号通路的关系,将SD大鼠随机分为假手术(sham)组,I/R损伤组,I/R+表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)(I/R+EGF)组(于缺血后90 min尾静脉注射EGF,1μg/kg),I/R+EGF+EGFR特异性拮抗剂AG1478(I/R+EGF+AG1478)组(于缺血后30 min腹腔注射AG1478,1 mg/kg)。为探讨JAK2/STAT3信号通路在激动EGFR抗大鼠脑I/R损伤中的作用及可能机制,本研究使用了JAK2/STAT3信号通路抑制剂AG490,并将SD大鼠进一步分为sham组,I/R组,I/R+EGF组,I/R+EGF+JAK2/STAT3信号通路特异性抑制剂AG490(I/R+EGF+AG490)组(于缺血后105 min腹腔注射AG490,3 mg/kg)。sham组大鼠进行手术操作,但线栓插入深度不至大脑中动脉。sham组与I/R组均给予等量的生理盐水。以上各组为保证每组成功造模大鼠数量不少于10只。大鼠缺血2 h后拔出线栓,维持血液再灌注24 h后,采用Longa五分法检测大鼠神经功能障碍;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5,triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法检测大鼠大脑梗死体积百分率变化;末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记测定法(terminal dexynucleotidyl transferase(Td T)-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL)染色法检测大鼠大脑皮层组织神经细胞凋亡情况;Western blot法检测p-EGFR、p-STAT3、Bax及Bcl-2等蛋白的表达。2.体外:取新生24 h内SD大鼠的大脑皮层组织进行原代神经元细胞培养,并制备神经元细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤模型。将细胞分为正常对照(control)组、H/R组、H/R+EGF组(于缺氧前1 h加入EGF,使终浓度为50 ng/ml)、H/R+EGF+AG1478组(于缺氧后加入AG1478,使终浓度为10μmol/L)、H/R+EGF+AG490组(于缺氧前45 min加入AG490,使终浓度为50μmol/L)。MTT法检测神经元细胞的存活率;Hoechst 33258法检测神经元细胞的凋亡情况;Western blot法检测p-EGFR、p-STAT3、Bax及Bcl-2等蛋白的表达。结果:体内:1.Longa五分法结果显示,与sham组相比,当大鼠发生脑I/R损伤后,神经行为学评分明显增高。在使用EGF后,与I/R组大鼠相比,大鼠神经功能障碍情况有所改善,神经行为学评分降低。然而在激动EGFR的基础上使用AG1478阻断受体以及使用AG490抑制JAK2/STAT3信号通路的激活后,与I/R+EGF组相比,大鼠的神经行为学评分均增高。2.对不同组大鼠进行TTC染色后发现,与sham组相比,I/R组大鼠大脑梗死体积百分率明显增高。EGF处理后,与I/R组相比,大鼠脑组织梗死体积百分率明显降低。然而在激动EGFR的基础上,使用AG1478以及AG490干预后,与I/R+EGF组相比,大鼠脑组织梗死体积百分率均增高。3.大鼠大脑缺血2 h再灌注24 h后,对不同组大鼠大脑皮层组织进行TUNEL染色检测各组大鼠大脑皮层组织中神经细胞凋亡情况。结果发现,与sham组相比,I/R组大鼠神经细胞凋亡率显著增高。激动EGFR后,与I/R组相比,神经细胞凋亡率降低。在激动EGFR的基础上使用AG1478阻断受体以及使用AG490抑制JAK2/STAT3信号通路的激活后,与I/R+EGF组相比,神经细胞凋亡率增高。4.大鼠大脑缺血2 h再灌注24 h后,采用Western blot法检测p-EGFR、p-STAT3、Bax及Bcl-2等蛋白的表达。结果显示,与I/R组大鼠相比,在使用了EGF处理后,大鼠的p-EGFR表达增高,JAK2/STAT3信号通路被激活,p-STAT3表达也增高而Bax/Bcl-2比值降低。在AG1478阻断EGFR受体以及AG490抑制JAK2/STAT3信号通路激活后,与I/R+EGF组相比,p-STAT3表达水平均降低,Bax/Bcl-2比值均增高。体外:5.采用MTT法检测神经元细胞的存活率,结果显示,与control组细胞相比,神经元细胞在H/R损伤后细胞的存活率降低。使用EGF预处理后,与H/R组相比,神经元细胞存活率增高。与H/R+EGF组相比,在激动EGFR的基础上使用AG1478阻断受体以及AG490抑制JAK2/STAT3信号通路的激活后,神经元细胞存活率均降低。6.采用Hoechst 33258法检测神经元细胞凋亡情况,结果显示,与control组相比,H/R组神经元细胞凋亡显著增高。与H/R组相比,在使用EGF预处理后,神经元细胞凋亡率降低。在激动EGFR基础上进一步使用AG1478阻断受体以及AG490抑制JAK2/STAT3信号通路之后,与H/R+EGF组相比,神经元细胞凋亡增高。7.采用Western blot法检测神经元细胞中p-EGFR、p-STAT3、Bax及Bcl-2等蛋白的表达,结果显示,当神经元细胞发生H/R损伤后,Bax/Bcl-2比值增高。当使用了EGF预处理后,EGFR被激动,JAK2/STAT3信号通路被激活,与H/R组相比,p-STAT3表达增高,Bax/Bcl-2比值降低。在激动EGFR基础上使用AG1478阻断受体以及AG490抑制JAK2/STAT3信号通路激活之后,与H/R+EGF组相比,p-STAT3表达水平均降低,Bax/Bcl-2比值均增高。结论1.激动EGFR所产生的抗大鼠脑I/R损伤的作用与其激活JAK2/STAT3信号通路有关。2.JAK2/STAT3信号通路的激活可减少大鼠脑I/R损伤引起的细胞凋亡,在激动EGFR后发挥抗大鼠脑I/R损伤的作用。3.JAK2/STAT3信号通路的激活可降低Bax/Bcl-2的比值而减少神经细胞凋亡,在激动EGFR后发挥抗脑I/R损伤的作用。