目的强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种主要累及脊柱、骶髂关节及外周关节的慢性免疫性炎性疾病,其根本发病机制尚不清楚。近年来的研究表明,CD4+T细胞亚群调节性T细胞(regulatory T cells,Treg cells)、辅助性T细胞17(T-helper cells 17,Th17 cells)以及辅助性T细胞1(T-helper cells 1,Th1 cells)等均可能参与AS发病。其中CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞是体内重要的抑制性T细胞,它们可以在体内和体外抑制多种免疫细胞功能,从而维持自身免疫耐受及免疫平衡。如果实验动物Treg细胞发育异常,会发生严重的自身免疫性疾病。既往文献表明Treg细胞参与多种自身免疫性疾病的发生,如多发性硬化(multiplesclerosis,MS)与1型糖尿病(type1 diabetes,T1D)等。目前各CD4+T细胞亚群,尤其是Treg细胞与AS发生发展的关系尚未明确。为了研究Treg细胞等CD4+T细胞亚群参与AS发病的分子机制,我们进行了本研究。方法收集活动性及稳定性AS患者外周血,分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),应用流式细胞术从PBMCs中分选SYTOX Green-CD4+CD25-CD45RA+幼稚T细胞(na?ve T cells,Tn cells)和SYTOX Green-CD4+CD25high Treg细胞。第一部分检测Tn细胞的增殖、凋亡及向CD4+T细胞亚群Th17细胞诱导分化的能力。取分选的Tn细胞,用5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(5,6-carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)标记后,加入抗-CD3/CD28磁珠培养,于细胞培养第5天收集细胞,用流式细胞仪检测并分析Tn细胞增殖;取分选的Tn细胞,加入抗-CD3/CD28磁珠培养,于细胞培养24小时和72小时分别收集细胞,用AnnexinⅤ和PI将细胞染色后,15分钟内用流式细胞仪检测并分析早期与晚期凋亡的Tn细胞比例;取PBMCs,用流式细胞仪检测IL-23R表达情况,同时取分选的Tn细胞,加入抗-CD3/CD28磁珠与Th17细胞诱导分化细胞因子重组人白细胞介素6(recombinant human interleukin 6,rhIL-6),重组人转化生长因子β1(recombinant human transforming growth factorβ1,rhTGF-β1),重组人白细胞介素1β(recombinant human interleukin 1β,rhIL-1β),重组人白细胞介素23(recombinant human interleukin23,rhIL-23)培养,于细胞培养第三天和第七天检测Th17细胞诱导分化比例。第二部分应用细胞流式染色法分析PBMCs中Treg细胞等CD4+T细胞亚群比例及其相应的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)。取PBMCs,加入适量相应的细胞外、细胞内以及细胞核内流式抗体染色后,用流式细胞仪检测并分析Treg细胞,Th17/Th1细胞比例及相应MFI。第三部分检测Treg细胞对Tn细胞增殖的抑制功能。取分选的Tn细胞,用CFSE标记后单独或者与分选的Treg细胞共培养,同时加入抗-CD3/CD28磁珠,于细胞培养第5天收集细胞,用流式细胞仪检测并分析Treg细胞对Tn细胞增殖的抑制功能;同时用酶联免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测Treg细胞与Tn细胞共培养上清液中转化生子因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)、颗粒酶B(Granzyme B)、白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)和白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)等细胞因子的浓度。第四部分检测Treg细胞IL-2信号通路(包括IL-2使用及其下游信号通路)是否异常。取分选的Tn细胞单独或者与Treg细胞共培养,同时加入抗-CD3/CD28磁珠,细胞培养第5天收集细胞,提取mRNA并反转录为cDNA,应用实时定量PCR(Real-Time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测Tn细胞IL-2 mRNA表达及Treg细胞相关细胞因子m RNA表达。同时取分选的Treg细胞,在IL-2刺激后不同时间点检测其信号转导与转录激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)的磷酸化水平。第五部分检测Treg细胞FoxP3基因中保守的非编码序列(the conserved non-coding DNA sequence,CNS)2表观遗传学调控是否异常。取分选的Treg细胞,提取基因组DNA,应用亚硫酸氢钠测序分析其FoxP3基因CNS2区域10个Cp G岛甲基化水平。数据采用GraphPad Prism 7.6.1软件进行统计描述和分析。p<0.05为差异具有统计学意义。结果1.与健康对照者相比,活动性AS患者Tn细胞增殖、凋亡及向CD4+T细胞亚群Th17细胞诱导分化功能均没有明显改变。2.与健康对照者相比,稳定性AS患者与活动性AS患者PBMCs中Treg细胞,Th17/Th1细胞等CD4+T细胞亚群比例均没有明显改变。但活动性AS患者Treg细胞FoxP3 MFI显著下降,提示Treg细胞功能异常。3.与健康对照者相比,活动性AS患者Treg细胞不能有效抑制Tn细胞增殖,说明活动性AS患者Treg细胞功能有缺陷。4.与健康对照者相比,活动性AS患者Treg细胞与Tn细胞共培养上清液中IL-2浓度增高,同时qPCR检测结果表明AS患者Tn细胞并没有比健康对照者Tn细胞分泌更多IL-2,在共培养体系中的Tn细胞利用IL-2也并未减少,这些结果表明活动性AS患者Treg细胞可能存在IL-2利用缺陷,从而导致其使用IL-2减少。进一步检测IL-2刺激后不同时间点Treg细胞STAT5磷酸化水平,发现活动性AS患者在IL-2刺激后Treg细胞STAT5表达增加,但是其磷酸化水平却没有相应增加,这说明Treg细胞存在STAT5磷酸化不足或者不稳定。以上结果表明活动性AS患者Treg细胞IL-2信号通路确实存在异常,这可能会影响Treg细胞功能。5.活动性AS患者Treg细胞FoxP3基因表观遗传学调控异常,其CNS2区域Cp G岛甲基化水平升高。结论本课题首先研究了Treg等CD4+T细胞亚群是否参与AS发病。在这部分中我们检测了活动性AS患者CD4+T细胞亚群分化前Tn细胞的增殖,凋亡以及向CD4+T细胞亚群Th17细胞诱导分化的能力,并没有发现异常。我们进一步分析了AS患者PBMCs中CD4+T细胞亚群Treg细胞以及Th17/Th1细胞的比例及相应MFI,首次发现活动性AS患者Treg细胞FoxP3 MFI明显下降,提示Treg细胞功能异常。因此我们进一步检测了Treg细胞对Tn细胞的增殖抑制功能,结果发现活动性AS患者Treg细胞不能有效抑制Tn细胞增殖。这些结果证明活动性AS患者Treg细胞确实存在功能缺陷。在发现活动性AS患者Treg细胞存在功能缺陷的基础上,本课题进一步重点研究了Treg细胞功能缺陷的可能机制。一方面我们检测了活动性AS患者Treg细胞IL-2利用及IL-2下游信号通路是否异常,结果发现Treg细胞利用IL-2能力下降,在IL-2充足时也不能很好的利用环境中的IL-2,同时IL-2下游重要信号分子STAT5磷酸化水平相对不足或者不稳定。另一方面我们检测了活动性AS患者Treg细胞FoxP3基因表观遗传学调控,发现其CNS2区域CpG岛甲基化水平异常升高。IL-2信号通路异常与CpG岛甲基化水平升高共同引起Treg细胞抑制功能异常,最终导致AS发生。目前,靶向Treg细胞治疗自身免疫性疾病和炎性疾病方兴未艾,已取得突破性进展,目前应用不同方法恢复Treg细胞数量以及功能而治疗系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、MS、银屑病和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)等疾病均有报道。本研究的发现为临床上靶向恢复Treg细胞功能治疗AS提供了理论依据,也为从根本机制上治疗AS提供了更多方向与选择。