第一部分：开发一套基于PCR和二代DNA测序技术的方法,以测量人脑中阿尔茨海默症候选基因的等位位点特定mRNA表达,并建立全新的数学模型以确定潜在的顺式作用eQTLs及调控遗传变异调节mRNA表达量的常见遗传变异可能会导致各种复杂疾病,其中就包括阿尔茨海默症(AD)。在这一疾病中,毒性β淀粉样蛋白的过量生成会提高疾病的发生风险。在全基因组关联分析(GWAS)中被发现与阿尔茨海默症相关的单核苷酸多态性(SNPs)主要位于内含子或基因附近的非编码区,而非蛋白质编码区内,这一发现暗示在这一疾病中,基因调控可能具有重要作用。尽管基于高通量微阵列芯片的方法已经被广泛用于测量独立样本之间的mRNA表达差异,但是如果要检测罕见的mRNAs,它们往往缺乏足够的灵敏度,而如果要检测由基因型所导致的mRNA表达水平细微变化,它们也常常缺乏足够的准确性,因为非遗传因素往往会造成不同个体之间mRNA表达本身就存在巨大的背景差异。在这一章节中,主要描述了一种全新且高效的基于聚合酶链式反应(PCR)和二代测序(NGS)技术的方法,通过使用mRNAs中的“标记”SNPs来区分等位基因位点,最终可以对人脑中AD候选基因的等位位点特定mRNA表达进行分析。通过这一方法,我们成功的在52例独立的人脑样本中,针对21个AD候选基因的,分析了其mRNA表达中出现的等位位点表达不平衡(AEI)。在这些基因中,20/21(95%)在至少一例样本中存在超过1±0.2的AEI比值,而只有1/21(5%)没有出现明显AEI现象。这些结果证明,人脑中AD候选基因的mRNA表达普遍存在等位位点特定的差异,从而使得我们有理由推测,引起这些基因表达差异的遗传因素完全有可能单独或一同作用,并最终导致AD的发生。除了观察到mRNA表达普遍存在差异外,我们还注意到,如果将每例脑样中所得到的AEI比值转换至1og2水平,再按照从最负值向最正值排列,那么对于每个基因／标记SNP组合,都会出现一种高度特异的log2AEI匕值分布。基于这些发现,我们开发出了一套数学框架模型以分析这些分布情况,并发现log2AEI的分布情况暗含了大量重要信息,包括调节mRNA表达的潜在顺式调控变异的数量、位置及其作用大小。理论上我们的这些数学模型还可以扩展至包括eQTLs,因此有可能作为第一种统一的框架用于分析等位位点特定以及总的mRNA表达。总之,我们开发出了一套高灵敏度和准确性的方法,用于确定人脑中所表达mRNA的等位位点特定差异,此外我们还开发出了一套数学模型来分析这些差异。我们的这一方法使得我们可以测量到大量AD候选基因的mRNA表达差异,而这些基因在之前同样针对人脑的研究中可能都完全被遗漏了,此外通过这一方法,我们还可以确定出直接导致mRNA表达水平差异的候选遗传变异或是能够准确预测mRNA差异的SNPs。而这些能够准确预测mRNA表达量高低的SNPs等位位点应该可以作为有效的标记用于AD关联分析研究,从而最终确定导致AD的单个基因或基因组合。第二部分:PION基因启动子区域中的常见调控性遗传变异与阿尔茨海默症相关且独立于APOE4作用阿尔茨海默症(AD)是一种常见而又具有毁灭性的神经退行性疾病,当前在全球范围内的患者数量约有3600万(阿尔茨海默症国际组织：2009世界阿尔茨海默报告),并给患者及其家庭带来了难以言喻的痛苦。随着当前人口老龄化速度加快,预计到2050年将有多达1亿1500万人会身患此症(2009世界阿尔茨海默报告)。迄今为止对于AD还没有有效的治疗或预防方法。出于这一原因,人们普遍寄希望于能够阐明导致AD的遗传因素,从而向着治疗甚至预防这一疾病的方向迈出强有力的第一步。当前越来越多的研究者普遍认为,调节基因表达量的调控变异在复杂疾病中有着重要作用,其中就包括AD。基于人们发现毒性淀粉样多肽(Aβ)的过量生成会明显提高被确诊为AD的风险,而又有多种独立的蛋白质直接或间接的影响了这一毒性多肽的生成,因此我们推测,在编码Aβ生成相关蛋白的基因中,如果存在某些遗传因素导致其表达量改变,那么这些遗传因素可能也会影响AD的发病风险。在这些基因中,我们决定关注于PIoN。这一基因的功能尚不清楚,但它编码了丫分泌酶激活蛋白(gSAP)的前体,而gSAP则会增强丫分泌酶对p淀粉样蛋白前体(APP)的剪切,从而增加毒性Aβ的生成。在这一章节中,主要描述了：1)使用实时定量PCR方法并结合全基因组基因分型数据,以证实人脑中PION mRNA的表达受到常见遗传变异的调控,以及2)通过AD病例对照关联分析,确定了PION在中国汉族人群以及高加索人群中都是一个全新的AD易感基因。特别的,我们证实了人脑中PION mRNA的表达受到启动子区域中的某个遗传变异调控,并与SNP rs4727380是高度连锁关系,而rs4727380的次要等位位点G是低表达等位位点,主要等位位点C是高表达等位位点。使用rs4727380作为遗传标记,我们在397例AD汉族人病例和474例汉族人对照中进行了关联分析研究。这一研究首次证实PION与AD存在一定关联,且rs4727380的高表达等位位点被确定是致病型等位位点。这一结果与我们最初的假说相符,即PION的高表达会增加Aβ的生成并提高AD的患病风险。此外,我们进一步发现,rs4727380的致病型等位位点是隐性作用的,而这一SNP在载脂蛋白E等位基因4(APOE4)非携带者以及发病年龄(AAO)大于65岁的AD病例中与AD诊断的关联性最强。这些结果暗示PION对于AD的作用是独立于APoE4等位基因的,而后者是当前已知对于AD作用最为显著的遗传因素。这一结果还表明PION对于AD的作用可能需要很长一段时间才能显现,因此在迟发型阿尔茨海默症(LOAD)中作用最为显著。我们使用rs4727380作为遗传标记,在基于高加索人群的AD关联分析中获得了相似的结果或趋势,表明PION在中国汉族人群和高加索人群中可能都与AD相关。总之,我们发现人脑中PION mRNA表达水平存在差异,并鉴别出了一个位于启动子区域的SNP与表达量高度相关。这些结果使得我们确定了PION是一个全新的AD候选易感基因,并进一步证明了调控性遗传变异在AD中的作用。