【摘 要】
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1,5-戊二胺是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱,可由L-赖氨酸经赖氨酸脱羧酶直接脱羧生成,被广泛应用于农业、医学、化工等领域。全细胞催化生产1,5-戊二胺是目前最具潜力的工业生产方法,但仍受到底物/产物的转运效率的限制,且存在全细胞生物催化剂的活力随产物浓度的增加而显著下降等问题。本课题针对全细胞生物催化合成1,5-戊二胺的现存问题,探讨了全细胞催化过程中物质跨膜转运及能量供给机制,对全细
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1,5-戊二胺是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱,可由L-赖氨酸经赖氨酸脱羧酶直接脱羧生成,被广泛应用于农业、医学、化工等领域。全细胞催化生产1,5-戊二胺是目前最具潜力的工业生产方法,但仍受到底物/产物的转运效率的限制,且存在全细胞生物催化剂的活力随产物浓度的增加而显著下降等问题。本课题针对全细胞生物催化合成1,5-戊二胺的现存问题,探讨了全细胞催化过程中物质跨膜转运及能量供给机制,对全细胞催化合成1,5-戊二胺的关键条件进行了研究。研究内容包括以下几个方面:首先,研究ATP对全细胞催化合成1,5-戊二胺的影响。测定了全细胞催化150min后的胞内ATP含量变化,研究了ATP对纯化赖氨酸脱羧酶合成1,5-戊二胺的影响。结果表明,赖氨酸脱羧酶催化合成1,5-戊二胺时的ATP含量没有显著变化(P=0.625),且添加ATP对1,5-戊二胺生成量没有显著影响(P=0.374),表明酶催化过程不需要ATP的参与。此外,构建了共过表达甲硫氨酸腺苷转移酶(Met K)、赖氨酸脱羧酶(Cad A)和赖氨酸/1,5-戊二胺双向转运蛋白(Cad B)的E.coli BLDABK,用于研究ATP缺乏的全细胞转化剂合成1,5-戊二胺能力的变化。结果显示,在ATP缺乏状态下,单位菌体1,5-戊二胺生成量与对照组没有显著差异(P=0.585)。通过测定全细胞催化剂胞内外的1,5-戊二胺浓度和ATP/ADP的比值,表明在1,5-戊二胺合成过程中,胞外的1,5-戊二胺浓度远高于细胞内浓度,而ATP/ADP比值无明显变化,说明ATP不参与全细胞催化合成1,5-戊二胺的全过程。其次,研究胞内外pH对全细胞催化的影响。测定了胞外p H值(5.6-6.8)条件下添加离子载体羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)对1,5-戊二胺合成量的影响,结果表明,CCCP的抑制作用会随着外部p H的增加而降低。通过测定不同赖氨酸浓度下全细胞催化过程中胞内p H变化趋势,确定赖氨酸浓度为100 g/L时,1,5-戊二胺产量为1.418 g/g DCW,且胞内p H于稳定6.7左右。而后测定了胞内p H对全细胞催化合成1,5-戊二胺的影响,表明当胞内p H为7.2时,1,5-戊二胺产量最高,达到2.459 g/g DCW。最后,通过添加解耦联剂缬氨霉素和尼日利亚菌素检测了胞内外钾离子梯度对全细胞催化合成1,5-戊二胺的影响,结果表明添加缬氨霉素和尼日利亚菌素后全细胞的1,5-戊二胺产率(1.33 g/g DCW/min)是不添加组的1.56倍。进一步测定不同胞内钾离子浓度下全细胞催化1,5-戊二胺的产量,表明1,5-戊二胺的产量随胞内钾离子的降低而增加,在胞内钾离子浓度为5 m M时,1,5-戊二胺产量最高(1.971 g/g DCW)。综合考量胞内外p H和钾离子对质子动力势的影响,试验通过摇瓶试验和发酵罐放大试验分别验证了调控质子动力势对1,5-戊二胺合成的作用。结果表明,当胞内p H为7.2,胞内钾离子浓度为5 m M时,摇瓶试验转化120 min后的1,5-戊二胺产量为5.91 g/g DCW,是对照组的1.43倍;3 L发酵罐放大试验转化120 min后的1,5-戊二胺产量为7.43 g/g DCW,是对照组的1.15倍。
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