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研究目的:阐明L1CAM(L1 cell adhesion molecule)对肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并揭示调控L1CAM功能的分子机制。研究方案:1.L1CAM与肺腺癌的临床相关性研究收集蚌埠医学院第一附属医院2014-2017年间经手术完整切除的,并有配对癌旁正常组织的88例肺腺癌标本,使用免疫组织化学技术检测L1CAM的表达水平,并分析其表达量与患者预后的临床相关性。2.LICAM对肺腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响(1)在肺腺癌细胞A549、NCI-H1299及NCI-H1770中,过表达或沉默L1CAM,通过Transwell、细胞增殖和细胞划痕等实验检测L1CAM对肺腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响;(2)采用转座子系统构建sh L1CAM的小鼠原位肺癌模型,注射6周后处死小鼠,取肺组织标本计数肿瘤形成数量;(3)在H460SM细胞过表达或沉默L1CAM,通过经支气管肺内原位接种构建裸鼠气管内原位肿瘤模型,达到预期终点后处死裸鼠,并比较实验组与对照组肿瘤大小及转移情况。3.鉴定肺腺癌中上调L1CAM表达的通路及其对生物学功能的影响(1)在H1770细胞中通过si RNA干扰技术及Western blot检测沉默PAK4、Slug后,L1CAM表达情况;(2)在先前收集的肺癌患者手术标本中通过Western blot验证PAK4、Slug的蛋白表达水平;(3)通过生物信息学分析探索在抑制PAK4的mi RNA;(4)通过RNAi技术在SPC-A-1,SPC-A-1sci转染mi RNA或其抑制剂,采用q PCR,Western blot实验检测PAK4、Slug、L1CAM表达情况以及EMT相关蛋白(E-cadherin和Vimentin)的表达水平。(5)采用Transwell及划痕试验验证转染后的SPC-A-1及SPC-A-1sci细胞侵袭和迁移能力。(6)在裸鼠中尾静脉注射转染后的SPC-A-1sci或SPC-A-1细胞,7周后测量肺部转移瘤数量,进一步验证mi RNA通过PAK4/Slug/L1CAM途径在肺腺癌中发挥的生物学功能。研究结果:1.在收集的肺腺癌组织标本中,癌组织L1CAM表达水平高于与其配对的癌旁组织;患者生存分析表明L1CAM高表达组较之于低表达者预后差(P<0.05)。2.在A549,NCI-H1299,NCI-H1770细胞系中过表达L1CAM后,肺腺癌细胞侵袭和迁移能力较对照组明显增强;沉默L1CAM,上述三组肺腺癌细胞的侵袭和迁移能力显著降低,并可抑制小鼠肿瘤模型中原发性肺癌及转移瘤的数量。然而细胞增殖实验结果表明敲低或者过表达L1CAM后细胞增殖能力较对照组没有显著差异。3.在肺癌组织标本中,PAK4,p-Slug和L1CAM蛋白水平在肿瘤转移患者中高于未转移的患者。生物信息学分析表明,mi R-193a-3p与Slug的激活剂PAK4的3’-UTR结合。通过q PCR以及Western blot实验证实,mi RNA抑制PAK4表达后,p-Slug和L1CAM表达水平降低;而anti-193a-3p转染的SPC-A-1中PAK4表达上调,p-Slug和L1CAM表达水平增加。4.转染anti-193a-3p的SPC-A-1细胞中,SPC-A-1细胞较对照组上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达水平降低,间质细胞标志物波形蛋白Vimentin表达水平增加,提示anti-193a-3p促进转染后细胞的EMT进程;而转染mi R-193a-3p类似物的SPC-A-1sci的细胞较对照组E-cadherin蛋白表达水平增加,Vimentin蛋白表达降低,提示了EMT进程受到抑制。5.通过划痕试验证实,SPC-A-1sci细胞迁移能力明显减弱;SPC-A-1细胞较对照组迁移能力较对照组明显增加。6.在裸鼠中尾静脉注射转染后的SPC-A-1细胞系,肺组织中转移性肿瘤结节数明显较少,而anti-193a-3p组裸鼠的肺组织相对于其他对照组具有较多转移性结节数(P<0.01)。研究结论:1.L1CAM高表达与肺腺癌患者存活率降低密切相关;2.L1CAM表达水平与肺腺癌迁移和侵袭能力呈正相关,但对肿瘤增殖能力无明显影响;3.PAK4通过磷酸化Slug调控PAK4/Slug/L1CAM途径,促进L1CAM的表达;mi R-193a-3p通过下调PAK4的表达,抑制肺腺癌的EMT和迁移/侵袭能力。