【摘 要】
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(-)-vibo-栎醇是一种脱氧肌醇(1L-1,2,4/3,5-环己五醇),天然存在于橡树、蜜露蜂蜜、陈酿葡萄酒的橡木桶和匙羹藤植物中。由于其与葡萄糖结构类似,已被用作合成控制糖尿病药物的生物活性化合物的替代手性元件。本研究利用体外合成生物学平台,构建了主要由五种酶参与组成的体外酶促合成系统,其避免了 ATP参与,可一锅法将麦芽糊精转化为(-)-vibo-栎醇。这个系统中主要参与的酶有淀粉磷酸化酶
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(-)-vibo-栎醇是一种脱氧肌醇(1L-1,2,4/3,5-环己五醇),天然存在于橡树、蜜露蜂蜜、陈酿葡萄酒的橡木桶和匙羹藤植物中。由于其与葡萄糖结构类似,已被用作合成控制糖尿病药物的生物活性化合物的替代手性元件。本研究利用体外合成生物学平台,构建了主要由五种酶参与组成的体外酶促合成系统,其避免了 ATP参与,可一锅法将麦芽糊精转化为(-)-vibo-栎醇。这个系统中主要参与的酶有淀粉磷酸化酶(αGP)、磷酸葡萄糖变位酶(PGM)、2-脱氧-青蟹肌糖合酶(DOIS)、(-)-vibo-栎醇1-脱氢酶(QUDH)和甲酸脱氢酶(FDH)(用于NADH再生的酶)。通过对整个途径中的所需要的酶的表达及纯化条件的优化,途径中的所选用的重组酶能够在E.coli BL21(DE3)和Bacillus subtilis宿主中很好地表达。测定纯化后的酶活,确定反应体系温度为37℃,实现在一锅反应中将麦芽糖糊精生物转化为(-)-vibo-栎醇。为了实现整个途径底物到产物的高效转化,对反应体系中的酶比例、辅因子NAD+、无机磷、甲酸盐的浓度进行优化。确定反应的最优反应条件:αGP:PGM:DOIS:QUDH:FDH的比例为2:2:2:3:2,NAD+的浓度为2 mmol/L,无机磷的浓度为20 mmol/L,甲酸盐的浓度为70 mmol/L。另外,向该反应体系中补充异淀粉酶(IA)和葡聚糖转移酶(4GT)以提高对底物麦芽糊精的利用率。经过优化后,10 g/L的麦芽糖糊精生物转化为(-)-vibo-栎醇的产量为7.6 g/L,产率为77%。最后,为获得(-)-vibo-栎醇的更高产量,增大麦芽糖糊精浓度至50 g/L,结果(-)-vibo-栎醇的产量增加至25.3 g/L,产率为51.4%。本研究描述构建的体外多酶催化合成系统可将麦芽糖糊精生物转化为(-)-vibo-栎醇,并在工业规模化生产中具有巨大的潜力。
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