研究意义人体骨骼承担着机体运动、支撑体重和保护脏器等重要功能,因先天性、外伤、感染、肿瘤等原因造成的骨缺损是临床常见问题。据保守估计,美国每年因骨科疾病导致消耗数千亿美元。我国每年也有众多患者需要进行骨移植手术,消耗惊人。目前自体骨移植.、异体骨移植和人工合成骨填充材料为常见的骨组织修复方法,但这些治疗方法仍存在很多不足。自体骨移植：供区疼痛、失血、感染、结构被破坏功能影响、取骨数量有限；异体骨：免疫排斥反应,疾病传染,人工合成骨填充材料目前仍旧只能起到骨缺损填充、支持作用,骨诱导能力较弱。因此,如何更好的修复骨组织缺损,一直是修复重建研究领域的热点之一。近期,应用生物学和工程学技术、原理研究开发替代用组织工程骨为骨缺损的修复开辟了新途径、新方法。近年来,关于骨再生与重建机制的研究,新型骨移植材料、骨组织工程学的研究与应用,逐渐成为骨科领域的热点研究问题之一。体外构建与天然骨成分、结构相似的骨生物替代材料,被认为是解决上述难题的有效方法之一。磷酸钙骨水泥(Calcium phosphate cement, CPC)作为一种自固型非陶瓷羟基磷灰石类材料。具有良好的生物相容性和骨传导性、生物安全性、能任意塑形、在固化过程中等温,被认为是一种最为理想的骨替代生物材料。然而,骨生物材料的仿生化、功能化和其作用机制仍远未明确。骨生物材料成骨及成血管效果仍有待提高。目前,骨组织工程已形成了比较丰富的联合种子细胞、生物活性因子及生物材料支架构建生物功能化骨生物材料的理论和技术方法。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)能在体外增殖维持非分化状态并具有分化成：骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能,目前已在机体多个组织器官中成功提取到具有多分化潜能的MSCs。MSCs具有来源广泛,取材方便,生长稳定,增殖快,定向分化能力强,易于接种成活等优点,被认为是骨再生修复中最佳的种子细胞。在多来源的MSCs中,又以骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSCs)研究较多,相关研究已证实,BMSCs可增强骨生物材料成骨能力,促进新生骨生成。此外,各种生物活性因子也被广泛应用于增强骨生物材料的成骨成血管能力,其中富血小板血浆(PRP)作为一种取材方便的血小板浓缩物,激活后可释放多种生长因子,在促进骨细胞和成骨细胞的增殖、生长、分化和组织的形成过程中起着重要的作用。自1998年Marx等首次用PRP复合移植骨修复下颌骨缺损以来,PRP已逐渐应用于口腔、整形、骨科、耳鼻喉科、神经外科等领域的组织修复中。然而,骨组织工程领域对种子细胞的转归机制认识尚不明确,PRP对骨生物材料的成骨成血管效果尚存在争议。因此,加强骨生物材料的基础研究,利用仿生技术联合BMSCs和PRP构建新型生物功能化骨生物材料,阐明其在体内骨组织修复中的作用效果和作用机制,证实CPC不会引起严重的炎症反应及免疫排斥反应,同时了解其在体内的降解速度、骨传导及骨诱导性能,不仅对提高骨生物材料的认识具有相当的科学意义,也可为临床骨缺损的治疗提供全新的治疗思路和技术方法。研究目的本研究获取小型猪骨髓来源BMSCs,进行体外扩增,通过联合CPC与BMSCs共培养并成骨诱导分化,探讨CPC对小型猪BMSCs增殖及成骨分化的影响。此外,CPC联合BMSCs和PRP构建组织工程骨修复小型猪股骨髁标准骨缺损,评价生物功能化CPC复合材料在骨组织再生修复应用中的价值,为骨生物材料的基础研究,成骨及成血管提供实验资料和科学依据。研究方法1)构建CPC&BMSCs复合生物材料,评估CPC对BMSCs增殖及成骨分化影响高温煅烧钙磷比例约为1：9的磷酸氢钙和碳酸钙混合物,按摩尔质量比以1：1混合制备CPC粉末并塑型为直径12mm,厚度1.5mm的薄片支架,采用密度梯度离心法分离并扩增BMSCs,将第三代BMSCs与CPC支架于24孔培养板共培养,每个CPC支架种植细胞数3*105,添加成骨诱导培养基(含100nnM地塞米松,10mMβ-磷酸甘油,0.05mM抗坏血酸和10nM维生素D3)对BMSCs进行成骨诱导分化21天,对照组采用同样方法将BMSCs种植于材料,使用普通培养基培养。分别于第1、14、21天采用Live/Dead染色法对细胞生长活性进行检测,评估成骨组及对照组BMSCs增殖活力。pNpp定量法对碱性磷酸酶(ALP)活性进行检测,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测量其骨钙素(OC),Ⅰ型骨胶原(C01-Ⅰ),ALP及RUNx-2成骨基因的表达结果。同时采用茜素红染色法对在BMSCs材料支架进行染色并定量成骨过程形成的矿化物,评估不同试验组及不同时间点BMSCs成骨诱导分化结果。2)CPC联合BMSCs及PRP构建组织工程骨修复小型猪股骨标准骨缺损由合作单位马里兰大学提供相同CPC配方制成的直径7.8mm,高10mm圆柱体孔性CPC支架材料,实验动物为雌性小型猪,年龄12-18个月。每头动物均抽取髂骨骨髓,采用密度梯度离心法分离扩增至P2以获取足量的BMSCs。CPC材料支架经严格环氧乙烷消毒,植入骨缺损前24h进行BMSCs种植,将第二代BMSCs消化重悬于成骨诱导液,每个材料支架滴加100μL含106BMSCs的细胞悬液,至于孵箱培育,每隔1小时加入100μL成骨培养基,3小时后细胞基本于支架上贴附,加入足量培养基,培养术前备用。PRP由手术前即刻准备,于手术动物前腔静脉抽取全血10ml,采用200g转速离心20min,提取上清,进一步360g转速离心10min,移弃上清液,获得自体PRP,每200u凝血酶加入0.2mm110%氯化钙,配成凝血酶激活剂备用。采用速眠新和戊巴比妥钠联合麻醉动物,手术于每头动物双后肢股骨髁上建立直径8mm,深度10mm股骨标准骨缺损,第一批6周观察组6头动物共12个骨缺损,每4个随机骨缺损分别植入三种不同复合生物材料:1)CPC;2)CPC&BMSCs;3) CPC&BMSCs&PRP;第二批12周观察组6头动物共12个骨缺损,相同方法植入相应的组织工程骨。术后每2周拍摄X线片,观测骨缺损生长情况。分别于6周,12周静脉注射氯化钾处死动物取标本,进行MICRO-CT扫描,三维重建,计算各组剩余材料百分比(RMVF)和新生骨组织体积(MBV)。MICRO-CT扫描后所有标本以4%甲醛固定1周,然后树脂浸泡,乙醇梯度脱水,硬组织切片机切片,HE染色,观察各组材料降解、成骨及成血管结果,采用Image-Pro Plus6.0软件计算各组新生骨面积百分比(NBA),对比各组复合材料骨缺损修复效果。研究结果live/dead染色结果显示对照组与成骨组CPC表面活细胞比例及活细胞密度随时间呈上升趋势,第14天对照与成骨组活细胞比例分别升至94.8%和95.2%,对照组活细胞密度由第1天为193cells/mm2升至1116cells/mm2’成骨组活细胞密度由第一天184cells/mm2升至1115cells/mm2,成骨组与对照组细胞密度及活细胞比例对比均无统计学差异。ALP结果显示成骨组中BMSCs中ALP活性第7天时明显增高,第14天时达峰值为777±48(μMpNPP/min)/(mgProtein),相比第1天ALP活性109±24(μMpNPP/min)/(MgProtein)增高约7倍。而对照组各时间点ALP均呈现较低水平表达,最高第4天仅为127±20(μMpNPP/min)/(MgProtein)与成骨组相比,具有显著统计学差异(P<0.01)成骨组ALP基因表达第四天达峰值,约为第1天4倍,第7天稍下降。COL-Ⅰ及OC基因表达峰值均出现在第7天,分别为第1天表达量4倍及5倍,而RUNx-2基因表达峰值出现在第14天,为第1天表达量约2倍。对照组中BMSCs各成骨基因表达无出现明显峰值,说明BMSCs在普通培养基条件下不能向成骨细胞分化。同时茜素红染色可见,成骨组在第14天即可观察到材料表面有矿化钙盐组织形成。第21天钙盐沉积进一步增厚,颜色加深。而对照组则可观察到少量着色的细胞层,没有明显的钙盐组织生成。成骨组净生成矿化物由第7天2.32±0.41mM升至第21天5.59±0.2Mm,而对照组第7、14及21天矿化物生成量分别为0.23±01mM、0.32±0.07mM及0.49±0.08mM,各个时间点均相应低于成骨组矿化物生成量。通过联合BMSCs和CPC构建生物功能化复合材料,电镜扫描图片可以观察到BMSCs在CPC材料表面贴附生长,细胞伸展形态自然,表现出良好的生长活力。动物手术过程无动物出现麻醉死亡,术后无动物出现感染。X线结果显示,术后6周,各组植入材料均与周围骨组织发生一定程度的反应,材料与骨组织交界线逐渐模糊。术后第12周,材料周围骨组织进一步整合,尤其是CPC-SC&P组,材料与周围骨组织基本融合,交界处模糊不清。分别于两个时间点处死动物,每个组每个时间点含4个标本,共获取标本24个。MICRO-CT结果显示,术后第12周剩余材料体积分数(RMVF) CPC-SC&P组为25.45±1.74%,CPC组为38.33±3.49%,CPC-SC&P组RMVF明显低于CPC组,统计学差异显著(P<0.05).术后第12周,CPC&BMSCs&PRP组新生骨体积(NBV)为78.03±3.19mm3而CPC组NBV为53.36±5.36mm3.CPC-SC&P组显著高于CPC组,而CPC-SC组NBV为69.65±1.99mm3,与其余两组对比无显著统计学差异。硬组织切片HE染色显示,术后8周,各组材料均呈现不同程度降解并伴随新生骨组织长入。IPP软件统计结果显示CPC-SC&P组术后8周及术后12周新生骨面积百分数为16.87±0.66%及25.99±3.12%,均明显高于CPC组新生骨面积分数(P<0.05)。而CPC-SC&P组新生骨百分数与CPC-SC组相比较,无明显统计学差异。结论新型磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性,小型猪BMSCs在CPC表面具有较旺盛的增殖活力,并且可以获得良好成骨诱导效果,进一步的体内研究实验表明,新型CPC联合BMSCs和PRP构建生物活性化组织工程骨对小型猪股骨髁标准骨缺损修复效果比较满意,CPC材料在体内表现出良好的生物相容性,降解性能及骨传导性能,复合BMSCs及PRP则可进一步加快了材料的降解,提高骨缺损修复疗效。