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几丁质及其水解产物在病虫害防治、医药生产和饲料加工等多个领域具有广泛的用途,其专一性水解酶——几丁质酶(chitinase)已成为当前研究的热点,分离新的几丁质酶基因、构建高效表达工程菌,对实现几丁质酶产业化具有重要意义。本文采用PCR 技术,从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)分离 chiB 基因,并分析了该基因的 DNA 序列,构建了原核生物表达载体, 通过 IPTG 诱导表达,分别对该基因表达的蛋白产物进行了 SDS-PAGE 分析、生物活性和功能分析。结果表明: 1. 依据己克隆的 chiB 基因序列的同源性比较,设计了三对 PCR 扩增引物,采用 PCR技术,从粘质沙雷氏菌基因组中分离出一个大小约 1500bp 的特异 DNA 片段; 2. 通过特异片段的测序和与报道的 chiB 基因的序列同源性分析,结果显示,该克隆片段是阅读框为 1500bp 的功能基因,与 Serratia marcescens X15208、AB015997 的 chiB 基因序列的同源性均达到了 99%,与 Serratia liquefaciens AF399871chiB 基因的同源性达 87 %,而与其它不同菌种的 chiB 基因同源性较低,初步表明该片段是粘质沙雷氏菌几丁质酶 chiB 基因; 3. 利用载体 pET-22b(+),构建 chiB 表达载体 pET-chiB,通过验证分析表明,所克隆的基因 chiB 已置于表达载体的正确阅读框架下; 4. 表达载体 pET-chiB 经诱导表达,结果显示其表达的蛋白为可溶性蛋白,经 SDS-PAGE 分析,结果表明该基因表达的蛋白分子量为 52kDa; 5. 通过对表达载体的 SDS-PAGE 各种参数包括时间、温度和 IPTG 浓度诱导表达分析,结果显示最佳诱导时间为 3～4 小时;最佳诱导 IPTG 浓度为 0.5mmol/L;20℃～30℃为诱导表达的适宜温度,并以 25℃为最佳; 6. 以酵母菌为指示菌做抑菌圈试验,结果显示经不同浓度的 IPTG 诱导表达的蛋白液处理后,抑菌圈大小变化十分显著,并在 IPTG 浓度为 0.5 mmol/L 时抑菌效果最明显。 7. 通过对经不同浓度的 IPTG 诱导表达的几丁质酶活力测定结果显示,当 IPTG 浓度为 0.5mmol/L 时,几丁质酶活力达到最大值 68.7U/ml,远高于原菌液几丁质酶表达的酶活力 11.63U/ml。 综上所述,本文已成功地从粘质沙雷氏菌中分离出几丁质酶 chiB 基因,并构建了高效原核表达载体 pET-chiB,同时优化了该工程菌诱导表达的参数,这些结果为几丁质酶基因的进一步研究和几丁质酶的产业化生产奠定了良好的前期工作基础。