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冷诱导RNA结合蛋白(Cold-inducible RNA binding protein,CIRP,也称CIRBP或A18 hnRNP)是一种在脊柱动物的组织和器官内广泛存在且表达高度保守的蛋白,属于RNA结合蛋白——核内异质核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)家族。前期研究发现CIRP在多种应激条件下过量表达,对细胞起到保护作用。CIRP还参与细胞生长、生殖发育、神经调节以及癌症发生等多种生理和病理过程的调控。早期的研究报道在小鼠成纤维细胞中过表达CIRP可延长细胞G1期来抑制细胞增殖,而近年的研究表明CIRP在小鼠胚胎成纤维细胞和小鼠精原细胞的增殖过程起促进作用。因此CIRP可能在不同类型的细胞中对其增殖的影响存在不同。CIRP还在爪蟾前肾形成过程中起到重要作用,但目前对哺乳动物肾脏的发育报道极少。本实验旨在探讨CIRP对BHK-21细胞增殖的影响及其分子机制,鉴定其新功能,深化对CIRP调控细胞发育作用的认识。取得如下成果:1证明CIRP对BHK-21细胞增殖起正向调节作用为了研究CIRP对BHK-21细胞生长的影响,本实验成功构建并验证了CIRP过表达BHK-21细胞(Cirp+BHK-21)和CIRP敲低BHK-21细胞(Cirp-BHK-21),对照细胞为表达绿荧光蛋白的BHK-21细胞(GFP-BHK-21)。随后我们测定了Cirp+BHK-21和Cirp-BHK-21在0、24 h、48 h、72 h、96 h的活细胞数,绘制出生长曲线及计算比生长速率。结果显示,在相同条件下,Cirp+BHK-21的活细胞个数在24~72 h显著高于对照细胞(P﹤0.05),在72~96h达到差异极显著(P﹤0.01),在24~96 h之间的平均比生长速率分别为0.023±0.015 h-1和0.020±0.012 h-1。而Cirp-BHK-21的活细胞个数在0~48 h之间与对照细胞无明显差异,但在48h-96 h之间显著低于对照细胞(P﹤0.05),在48~96 h之间的平均比生长速率分别为0.010±0.005 h-1和0.008±0.003 h-1。由此可见,CIRP的过表达能促进BHK-21细胞的增殖,其敲低也能抑制BHK-21细胞的增殖,证明CIRP对BHK-21细胞增殖起正向调节作用。因此本结果提示cirp对哺乳动物肾细胞发育起着重要作用。2过表达cirp的bhk-21连续传代后改变了细胞形态在试验过程中,经过连续传代培养,cirp+bhk-21细胞至第10代时,意外地发现其细胞形态由原本的梭形逐渐变为了不规则的圆形,我们将其记作cirp+bhk-21△。通过he染色进行观察,cirp+bhk-21△的细胞核出现巨核化、多核化,细胞整体呈饱满状。随后,通过采用扫描电镜观察到,cirp+bhk-21△的表面极不光滑,周围具有较多的泡状物,每个细胞几乎都有许多发达的伪足,这些伪足从细胞膜边缘伸出到无细胞区域,有的与邻近细胞的伪足相互紧密连接或嵌合,而伪足又是肿瘤细胞的一个重要结构。由于cirp本身是一个原癌基因,在多种肿瘤细胞中都有高表达,那么,进一步验证cirp的过表达是否导致了bhk-21细胞癌化是值得研究的。本结果显示了cirp能够改变bhk-21细胞的形态,但关于cirp对细胞骨架的调节还未见报道,因此有必要进一步研究其分子机制。3过表达cirp加快bhk-21细胞周期的进程为了进一步验证cirp对bhk-21细胞增殖的影响,我们采用流式细胞术对cirp+bhk-21△、gfp-bhk-21、cirp-bhk-21的细胞周期进行了检测。取生长良好的上述三种细胞,将其制成细胞悬液后,经过乙醇固定,tritonx-100处理,碘化丙啶(pi)对dna进行染色后,使用流式细胞仪检测细胞周期。结果显示在相同条件下,cirp+bhk-21△、gfp-bhk-21、cirp-bhk-21处于g0-1期的dna含量比例(即细胞数量比)依次为52.4%、55.3%、66.7%,处于s期的dna含量比例依次为26.1%、24.7%、19.7%,g2-m期的dna含量比例依次20.8%、12.7%、8.5%,即cirp+bhk-21△细胞处于g0-1期的细胞减少,而s期和g2-m期的细胞增多,细胞周期进程从g1期至s期的转变加强了,说明cirp能够促进bhk-21细胞提前进入s期,从而促进了bhk-21细胞的增殖,但其具体的分子机制还有待进一步验证。4bhk-21细胞中与cirp相互作用的候选靶蛋白的筛选为了研究cirp影响bhk-21细胞生长发育的分子机制,本试验利用免疫共沉淀(co-ip)结合质谱(ms)的方法,在cirp过表达的bhk-21(cirp+BHK-21)和变形BHK-21(Cirp+BHK-21△)中对与CIRP互作的候选靶蛋白进行了初步筛选。在Cirp+BHK-21中,共有24个蛋白被沉淀下来,根据Mascot软件排出与CIRP结合能力得分前五的蛋白分别为:G3bp1、Caprin1、Pabpc1、Alb、G3bp2,经分析得出G3bp1、G3bp2和Caprin1均已被证明与细胞生长发育密切相关,因此我们推测CIRP可能通过与这些蛋白互作来调节BHK-21细胞的增殖。在变形细胞(Cirp+BHK-21△)中,共有55个蛋白被沉淀下来,其中得分排在前五的蛋白分别为:Tpm1、Tpm3、Tpm2、Gapdh、Myh10,经分析得出这5个蛋白均与细胞骨架的调节有关,因此我们推测CIRP可能通过与这些蛋白互作来调节BHK-21的细胞形态。本结果为进一步研究CIRP影响BHK-21细胞生长发育的分子机制提供了新的线索。