胰岛素样生长因子1（Insulin like growth factor1，IGF1）是一种多功能肽，可以调节细胞生长、细胞分化，以及细胞外基质中多种蛋白表达。大量基础和临床研究证明，IGF1是骨形成和骨重建过程中的关键蛋白。但IGF1促进或抑制骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs）向成骨细胞分化尚未定论。此外，有关IGF1对BMSCs向成骨细胞分化影响的分子机制和信号通路尚不清楚。BMSCs是在骨髓中存在的一种具有多向分化潜能的干细胞，可以向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞或肌肉细胞等进行分化。正常情况下，BMSCs向成骨细胞和脂肪细胞两者的分化处于动态平衡，其分子调控机制具有非常重要的医学意义。具有盘状同源区域（PDZ）结合序列的转录共活化因子（Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ），在调节BMSCs成骨和成脂分化的平衡中发挥着非常重要的作用。相关研究证明，TAZ可以促进BMSCs向成骨细胞分化，同时阻止BMSCs向脂肪细胞分化。目前尚未清楚的是，IGF1对BMSCs向成骨细胞分化具有促进还是抑制作用？IGF1对BMSCs中TAZ的表达有何影响？IGF1主要通过哪些通路调控TAZ的表达？已有研究证明，血清IGF1浓度影响骨代谢。另外，某些药物，如生长激素（Growth hormone，GH），可能会增加血清IGF1浓度。生长激素缺乏症（Growth hormone deficiency，GHD）已经被明确界定为一种综合征，GHD病人所出现的一系列临床与生化方面的异常表现也已知晓。与健康人群相比，成年GHD患者可以表现为骨密度（Bone mineral density，BMD）降低。对于接受GH治疗的GHD病人，其血清IGF1浓度如何变化？GH-IGF1轴活性增加后，对GHD病人的BMD有何影响？是目前关注热点之一。本课题将动物细胞实验和临床荟萃分析相结合，从微观和宏观两个层面，研究IGF1对BMSCs向成骨细胞分化的影响和分子机制。研究内容包括三个部分：第一，采用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法分离大鼠BMSCs，并进行原代培养，优选其中一种用于后续实验，并对BMSCs纯度和向成骨细胞分化能力进行鉴定；第二，研究IGF1对大鼠BMSCs向成骨细胞分化的影响及量效关系，确定TAZ的表达变化在其分子机制中占有的重要地位；第三，采用荟萃分析，研究GH治疗对GHD患者血清IGF1的影响，以及GH-IGF1轴活性增加对其BMD的影响。上述三部分研究，分别借助基础医学和循证医学两个视角，论证了IGF1在骨代谢中的重要意义，为临床治疗骨质疏松及其它骨矿盐疾病提供实验依据和理论基础。第一部分大鼠BMSCs的原代培养和鉴定目的：优选分离大鼠BMSCs的适宜方法，并对大鼠BMSCs的纯度和向成骨细胞分化能力进行鉴定。方法：1采用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法分离大鼠BMSCs，并对两种方法获得细胞的数量、形态、生长曲线和生长周期进行比较；2采用流式细胞术，对大鼠BMSCs表面抗原进行检测，以鉴定其纯度；3采用成骨培养基对大鼠BMSCs进行培养，观察向成骨细胞诱导后其生长曲线的变化；4对大鼠BMSCs进行成骨诱导后，检测细胞的碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性，并对其进行茜素红（Alizarin red，AR）染色，鉴定其向成骨细胞分化能力，并观察其向成骨细胞分化进程。结果：1两种分离方法获得BMSCs的比较全骨髓贴壁法分离得到BMSCs的数量为密度梯度离心法的2倍以上，具有数量优势，两种分离方法得到的BMSCs在形态、生长曲线和生长周期方面没有明显差异。因此，选择全骨髓贴壁法用于后续实验。2大鼠BMSCs表面抗原鉴定结果采用流式细胞术对全骨髓贴壁法获得P3代细胞的表面抗原进行鉴定，结果发现，CD29/CD90共同表达的阳性率为91.41%；CD34/CD45共同表达的阳性率为1.24%。3大鼠BMSCs向成骨细胞分化能力鉴定结果经成骨诱导后，BMSCs的生长曲线出现明显变化，其增殖速度明显下降，而且对数生长期不明显；BMSCs经成骨诱导之后，ALP活性在不同时间点存在统计学差异，并存在时间递增效应，第3天、第7天和第14天的ALP活性高于第0天；第7天和第14天的ALP活性高于第3天；第7天和第14天的ALP活性没有统计学差异；BMSCs经成骨诱导之后，AR染色结果在不同时间点存在统计学差异，并存在时间递增效应，第3天和第7天的半定量结果没有统计学差异；第14天和第21天的半定量结果高于第3天和第7天；第21天的半定量结果高于第14天。结论：全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs更适用于后续实验；经全骨髓贴壁法分离得到的BMSCs纯度较高，符合实验要求；经成骨诱导后，细胞分化能力增强，增殖能力降低，并逐渐表现出成骨细胞特征。第二部分IGF1对大鼠BMSCs向成骨细胞分化影响的信号通路研究目的：确定IGF1促进还是抑制大鼠BMSCs向成骨细胞分化及量效关系，初步探索其分子机制。方法：1在成骨培养基中分别添加50、100和200ng/ml IGF1，观察不同浓度IGF1对细胞ALP活性和钙沉积量的影响，同时确定后续实验中IGF1的适宜浓度；2采用Real-time RT PCR和Western Blot方法，检测IGF1对TAZ，Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor2，RUNX2）和骨钙素（osteocalcin，OCN）的mRNA和蛋白水平的影响；3采用小干扰RNA（Small interfering RNA，SiRNA）技术阻断TAZ表达，观察SiTAZ能否抑制IGF1诱导的BMSCs向成骨细胞分化的增加；4应用UO126（MEK-ERK阻断剂）和LY294002（PI3K-Akt阻断剂），确定IGF1对TAZ表达产生影响的优势通路。结果：1IGF1促进BMSCs向成骨细胞分化ALP活性检测和AR染色结果显示，IGF1可以增加大鼠BMSCs的ALP活性和钙沉积量，并存在剂量反应关系，其产生最大效应的浓度为100~200ng/ml。2IGF1对TAZ，RUNX2和OCN表达的影响Real-time RT-PCR和Western blot结果显示，IGF1可以在BMSCs向成骨细胞分化早期（第3~7天）上调TAZ和RUNX2的表达，而在BMSCs向成骨细胞分化的晚期（第7~14天）上调OCN的表达。3SiTAZ转染抵消了IGF1对BMSCs向成骨细胞分化的促进作用Real-time RT-PCR和Western blot结果显示，SiTAZ的转染可以成功降低TAZ的mRNA水平和蛋白表达。ALP活性检测和AR染色结果显示，IGF1+SiTAZ组的ALP活性和AR染色半定量结果明显低于IGF1+SiCON组；而且，ALP活性和AR染色半定量结果在SiCON组，SiTAZ组和IGF1+SiTAZ三组之间没有统计学差异。4IGF1主要通过MEK-ERK通路上调TAZ的表达Real-time RT-PCR和Western blot结果显示，IGF1+UO126组TAZ的mRNA和蛋白水平低于IGF1组；但是，TAZ的mRNA和蛋白水平在IGF1+LY294002组和IGF1组之间没有统计学差异；此外，TAZ的mRNA和蛋白水平在对照组，UO126组，IGF1+UO126组和LY294002组之间没有统计学差异。结论：IGF1增加BMSCs向成骨细胞分化过程中的ALP活性和钙沉积量，并具有剂量反应关系；IGF1在BMSCs向成骨细胞分化早期上调TAZ和RUNX2的表达，在BMSCs向成骨细胞分化晚期上调OCN的表达；通过SiRNA阻断TAZ表达后，IGF1对BMSCs向成骨细胞分化的促进作用被抵消；IGF对TAZ表达的影响主要是由MEK-ERK通路介导的。第三部分GH-IGF1轴对成年GHD患者骨密度的影响：荟萃分析目的：与健康人群相比，成年GHD患者往往表现为BMD降低，但是，对接受GH治疗的GHD患者而言，GH-IGF1轴对BMD的影响尚存争议。本研究旨在探索GH-IGF1轴活性增加对成年GHD患者的BMD是否存在积极意义。方法：1对Medline，Embase和Cochrane Library数据库进行系统检索，获取相关文献；2利用标准化的电子表格对文献中的研究细节和研究数据进行提取；3建立随机效应模型进行荟萃分析，通过计算标准化均差（Standardized mean difference，SMD）及其95%可信区间（Confidenceinterval，CI），以及相应的P值来分析GH-IGF1轴对腰椎、股骨颈和全身BMD的影响；4采用Q检验评价纳入研究的异质性，采用Egger和Begg检验评价发表偏倚。结果：1纳入荟萃分析的文献共有20篇文献，包括936名研究对象纳入本荟萃分析。2GH治疗对血清IGF1的影响在本荟萃分析所纳入的文献中，几乎所有的研究均证实，经GH治疗后的GHD患者，其血清IGF1水平显著提高。3GH-IGF1轴对腰椎BMD的影响GH-IGF1可以提高腰椎BMD（SMD=0.429，95%CI [0.263，0.594]，P <0.001；I2=50.0%，P=0.007for Q test）。亚组分析结果显示，在美洲人亚组中，GH-IGF1对腰椎BMD的影响并不明显。4GH-IGF1轴对股骨颈BMD的影响GH-IGF1可以提高股骨颈BMD（SMD=0.377，95%CI [0.158，0.595]，P=0.001；I2=67.8%，P <0.001for Q test）。亚组分析结果显示，在某些亚组人群中，GH-IGF1对股骨颈BMD的影响并不明显，包括：GH治疗时间≤2年亚组和美洲人亚组。5GH-IGF1轴对全身BMD的影响GH-IGF1可以提高全身BMD（SMD=0.242，95%CI [0.019，0.466]，P=0.034；I2=69.6%，P <0.001for Q test）。亚组分析结果显示，在某些亚组人群中，GH-IGF1对全身BMD的影响并不明显，包括：GH治疗时间≤2年亚组；GH治疗采用固定剂量亚组；采用Hologic Inc骨密度仪进行测量的亚组；采用GE-Lunar Inc骨密度仪进行测量的亚组；欧洲人亚组；美洲人亚组和大洋洲人亚组。6异质性和发表偏倚在对腰椎BMD、股骨颈BMD和全身BMD结果进行荟萃分析的过程中，均存在异质性；进行亚组分析时，异质性可以消除或降低。Egger’s和Begg检验结果显示，本研究不存在发表偏倚。结论：GH-IGF1轴活性增加可以提高GHD患者BMD；但在某些亚组人群中，GH-IGF1对BMD的影响并不明显。