【摘 要】
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乳酸菌（Lactic acid bacteria）为动物肠道固有菌群,具有耐酸、耐胆盐、抗消化酶、黏附定植、维持肠道菌群平衡,非特异抗菌、抗腹泻等等多种益生功能。利用乳酸菌作为活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白质,被广泛应用于畜禽健康养殖和生物医药领域。但乳酸菌载体外源蛋白表达量相对较低是一个不争的事实,如何提高乳酸菌载体表达效率是一个亟待解决的技术问题。在乳酸菌表达载体中,启动子的活性强弱直接影响
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乳酸菌（Lactic acid bacteria）为动物肠道固有菌群,具有耐酸、耐胆盐、抗消化酶、黏附定植、维持肠道菌群平衡,非特异抗菌、抗腹泻等等多种益生功能。利用乳酸菌作为活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白质,被广泛应用于畜禽健康养殖和生物医药领域。但乳酸菌载体外源蛋白表达量相对较低是一个不争的事实,如何提高乳酸菌载体表达效率是一个亟待解决的技术问题。在乳酸菌表达载体中,启动子的活性强弱直接影响外源蛋白的表达,本项研究比较了不同组成型启动子对外源蛋白表达的影响。试图优化乳酸菌表达载体对外源蛋白的表达效率。本研究以大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体p PG为骨架,副干酪乳杆菌HLJ-27为宿主菌,比较了三种组成型强启动子Pldh、PHH、Phce对荧光素酶（LUC）、绿色荧光蛋白（EGFP）和氨苄青霉素酶（Ampr）等三种外源蛋白表达量的影响。分别构建了p PG-Pldh-LUC/HLJ-27、p PG-PHH-LUC/HLJ-27、p PG-Phce-LUC/HLJ-27、p PG-Pldh-EGFP/HLJ-27、p PG-PHH-EGFP/HLJ-27、p PG-Phce-EGFP/HLJ-27、p PG-Pldh-Ampr/HLJ-27、p PG-PHH-Ampr/HLJ-27和p PG-Phce-Ampr/HLJ-27 9株重组乳酸菌。以Western blot技术检测表达蛋白分子大小,鉴定外源蛋白的表达,并以ELISA方法检测外源蛋白的表达量,荧光定量PCR测定插入的外源基因m RNA转录水平以及测定表达蛋白的活性强度,综合评价不同启动子对外源蛋白表达量的影响。Western blot检测结果显示,构建的9株重组乳酸菌外源蛋白均获得表达,表达的LUC、EGFP和Ampr蛋白大小分别约为58 k Da、26 k Da和28 k Da。通过对LUC报告基因表达系统、EGFP报告基因表达系统以及Ampr报告基因表达系统的综合评价,三个启动子活性强弱依次为Pldh、PHH和Phce。为探究启动子数量与外源基因表达量的关系,本研究以Pldh启动子为对象,Ampr基因作为插入的报告基因,构建了p PG-Pldh-Ampr/HLJ-27、p PG-Pldh-Pldh-Ampr/HLJ-27和p PG-Pldh-Pldh-Pldh-Ampr/HLJ-27三株重组乳酸菌。Western blot结果显示三株重组菌均可表达Ampr报告基因,目的蛋白大小均为28 k Da;ELISA检测Ampr蛋白的表达水平、荧光定量PCR方法检测Ampr基因转录的m RNA水平以及氨苄青霉素活菌筛选试验检测Ampr酶活性的结果均显示三株重组菌中启动子活性均显著高于对照组（p PG-Ampr/HLJ-27）,且三启动子驱动外源基因表达的效率显著高于双启动子,双启动子驱动外源基因表达的效率显著高于单启动子。以上结果证明在三启动子载体系统中,启动子驱动外源基因表达量与启动子数量呈正向关系。为了进一步探究启动子与外源基因插入的顺序对蛋白表达量的影响,利用Pldh启动子与Ampr报告基因,构建了p PG-Pldh-Ampr-Pldh-Ampr/HLJ-27和p PG-Pldh-Pldh-Ampr-Ampr/HLJ-27两株重组菌。Western blot结果显示,两株重组乳酸菌均表达了Ampr报告基因,其大小约为28 k Da;ELISA检测Ampr蛋白的表达水平、荧光定量PCR方法检测Ampr基因的m RNA转录水平以及氨苄青霉素活菌筛选试验检测Ampr酶活性的结果均表明,重组菌p PG-Pldh-Pldh-Ampr-Ampr/HLJ-27启动外源基因表达的效率显著高于重组菌p PG-Pldh-Ampr-Pldh-Ampr/HLJ-27,且两株重组菌中启动子活性均显著高于对照菌p PG/HLJ-27。以上结果证明在双启动子载体系统中,连续串联两个启动子驱动外源基因表达效率比两个启动子分别驱动外源基因表达效率更高。
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