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弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse Large B-cell Lymphoma, DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤亚型，抗CD20单抗联合以蒽环类为基础的多药免疫化疗方案（R-CHOP）可使超过半数患者获得完全缓解甚至治愈。但是，复发难治性DLBCL患者缺乏有效的治疗手段。DLBCL一线免疫化疗耐药的机制十分复杂，抗CD20单抗的耐药性是其中的重要内容。抗CD20单抗靶向人成熟B细胞表面CD20分子，通过抗体依赖的细胞毒作用、补体依赖的细胞毒作用和诱导凋亡等机制发挥抗肿瘤作用。因此，肿瘤细胞 CD20表达减少或缺失是抗 CD20单抗耐药的主要原因。
microRNA(miR)-363来源于miR-17-92家族miR-106a-363基因簇，我们的前期研究显示miR-363在R-CHOP耐药患者中显著高表达，miR-363高表达与DLBCL患者的不良预后具有显著相关性，但miR-363高表达的机制尚不明确。使用UCSC数据库对miR-106a-363基因簇及其上游序列进行分析发现，在miR-363编码序列上游4kb处存在活化启动子相关的H3K4me3、H3K27Ac以及CpG岛等结构，提示CpG岛附近可能存在潜在的启动子调控元件。荧光基因报告试验证实序列具有启动子功能，是miR-106a-363基因簇的启动子。进一步研究显示，转录因子 c-Myc能够与 miR-106a-363基因簇启动子结合，调控miR-363表达。同时，c-Myc的结合能力受启动子甲基化水平的调控。综上所述，我们的研究发现miR-106a-363基因簇具有独特的启动子元件，其CpG岛甲基化水平负调控c-Myc介导的miR-363表达。
以往研究认为 CD20分子具有钙离子通道功能或直接调节钙离子通道活性，钙离子内流对抗CD20单抗介导的细胞凋亡十分重要。然而，有研究发现CD20缺陷的B细胞仍有钙离子内流反应，提示在B细胞中存在其他钙离子调节机制。近期报道B细胞表达一系列钙离子通道蛋白，参与调控细胞内钙离子浓度。我们的研究发现，L-型钙离子通道家族成员CACNA1C在R-CHOP耐药DLBCL患者中低表达，随后的研究显示CACNA1C通过与CD20分子相互作用稳定CD20蛋白结构，抑制CD20蛋白通过泛素化-蛋白酶体途径降解，维持CD20蛋白在 DLBCL肿瘤细胞表面的表达和稳定性，进而影响肿瘤细胞对抗CD20单抗的敏感性。荧光素酶报告试验证实miR-363负调控CACNA1C表达， miR-363过表达导致肿瘤B细胞表面CD20表达降低，诱导抗CD20单抗耐药。多种小分子物质能够调控L-型钙离子通道蛋白的活性，影响钙离子内流和细胞内钙离子浓度，进而调节细胞凋亡过程。我们的体外细胞试验和小鼠模型研究证实 CACNA1C相关的 L-型钙离子通道激动剂能够促进钙离子内流，增加抗CD20单抗诱导的肿瘤细胞凋亡，CACNA1C蛋白表达未受影响，提示L-型钙离子通道激动剂具有增加抗CD20单抗疗效和克服其耐药的潜在能力，L-型钙离子通道拮抗剂具有降低抗CD20单抗疗效和诱导耐药的可能性。
综上所述，本研究创新性发现miR-363高表达与DLBCL免疫化疗耐药相关，miR-106a-363基因簇启动子区高甲基化状态抑制转录因子 c-Myc介导的miR-363表达；L型钙离子通道蛋白CACNA1C通过与CD20蛋白相互作用，维持CD20蛋白在DLBCL肿瘤细胞表面的表达和稳定性；miR-363通过负调控CACNA1C表达导致抗 CD20单抗耐药；L-型钙离子通道调节剂能够影响抗CD20单抗介导的钙离子内流，从而影响其抗肿瘤作用，成为提高疗效的潜在方法。
第一部分：弥漫大B细胞淋巴瘤中miR-363调控机制的研究
目的：
以 DLBCL细胞株为研究对象，研究 miR-363受启动子甲基化调控与DLBCL不良预后的相关性及其机制。
方法：
从UCSC数据库获取miR-106a-363基因簇上游序列，生物信息学方法预测潜在的启动子区及功能元件。在293T细胞株中使用荧光报告基因试验验证所预测启动子的功能。在DLBCL细胞株中使用Western Blotting和ChIP方法检测c-Myc表达及miR-106a-363基因簇启动子与c-Myc结合情况；RT-PCR、BSP法检测不同 DLBCL细胞系 DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨处理前后的miR-106a-363基因簇启动子甲基化水平与miR-363表达的关系。
结果：
1. miR-106a-363基因簇具有独立的启动子结构，位于编码序列上游约4Kb处，荧光报告基因试验证实了该序列具有启动子功能，调控miR-363的转录。
2. miR-106a-363基因簇启动子区 CpG岛存在4个 E-box结构，转录因子c-Myc通过与E-box2区结合调控miR-363表达，该区域甲基化水平与miR-363表达呈负相关。
3.使用 DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨处理 DLBCL细胞可降低miR-106a-363启动子E-box2甲基化水平，上调miR-363表达。
结论：
1. miR-106a-363基因簇具有独立的启动子序列，转录因子c-Myc结合启动子区E-box结构调控miR-106a-363基因簇的转录。
2. DLBCL细胞中 miR-106a-363启动子区 CpG岛甲基化通过抑制 c-Myc与E-box结合负调控miR-363表达。
第二部分：miR-363介导弥漫大B细胞淋巴瘤耐药机制的研究
目的：
以初治DLBCL患者标本、DLBCL细胞株为研究对象，研究miR-363负调控CACNA1C表达与DLBCL细胞对抗CD20单抗耐药的机制。
方法：
以初治DLBCL患者标本为研究对象，检测R-CHOP方案耐药和敏感患者肿瘤细胞CACNA1C蛋白表达水平，分析其与患者预后的相关性。荧光素酶报告试验验证miR-363与CACNA1C表达的相关性。以DLBCL细胞株为研究对象，验证miR-363与CACNA1C表达的相关性及对抗CD20单抗敏感性的影响。构建CACNA1C稳定低表达细胞株，检测对抗CD20单抗疗效的影响。构建小鼠移植瘤模型，观察CACNA1C表达与肿瘤生长和对抗CD20单抗敏感性的关系。荧光定量PCR、免疫荧光、免疫共沉淀、Western Blot检测CANCA1C表达与CD20间的关系。使用蛋白酶体抑制剂处理CACNA1C低表达细胞株，检测CD20蛋白变化。使用L-型钙离子通道激动剂Bay K8644和抑制剂尼莫地平处理 OCI-Ly3、OCI-Ly7、OCI-Ly8，流式细胞术检测细胞凋亡，使用 DLBCL患者组织构建小鼠PDX模型，观察L-型钙离子通道调节剂对抗CD20单抗敏感性的影响。构建miR-363过表达和敲除的DLBCL细胞株，体外验证miR-363对CACNA1C的调控和对DLBCL细胞的影响。
结果：
1.CACNA1C低表达与R-CHOP方案耐药和不良生存相关，是R-CHOP方案的独立不良预后因素，但是，CHOP方案治疗的 DLBCL患者中 CACNA1C表达与预后无显著相关性。CACNA1C在正常B细胞发育不同阶段表达存在差异。
2.CACNA1C低表达在体外抑制抗CD20单抗介导的DLBCL细胞凋亡，在小鼠移植瘤模型中抑制抗CD20单抗介导的肿瘤消减。
3.抗CD20单抗处理后B细胞表面CACNA1C和CD20存在相互作用，这种蛋白互作抑制CD20降解，增强CD20蛋白稳定性。
4.体外和小鼠模型研究证实 L-型钙离子通道蛋白调节剂通过调控CACNA1C功能，影响抗CD20单抗介导的钙离子内流，调节DLBCL细胞对抗CD20单抗的敏感性。
5.miR-363负调控CACNA1C表达并引起CD20蛋白表达下降，抑制抗CD20单抗介导的DLBCL细胞凋亡。
结论：
1.miR-363负调控CACNA1C表达，增加CD20蛋白通过蛋白酶体途径降解，介导抗CD20单抗耐药。
2.靶向CACNA1C相关的L-型钙离子通道蛋白调节剂通过调控钙离子内流影响抗CD20单抗的疗效。
microRNA(miR)-363来源于miR-17-92家族miR-106a-363基因簇，我们的前期研究显示miR-363在R-CHOP耐药患者中显著高表达，miR-363高表达与DLBCL患者的不良预后具有显著相关性，但miR-363高表达的机制尚不明确。使用UCSC数据库对miR-106a-363基因簇及其上游序列进行分析发现，在miR-363编码序列上游4kb处存在活化启动子相关的H3K4me3、H3K27Ac以及CpG岛等结构，提示CpG岛附近可能存在潜在的启动子调控元件。荧光基因报告试验证实序列具有启动子功能，是miR-106a-363基因簇的启动子。进一步研究显示，转录因子 c-Myc能够与 miR-106a-363基因簇启动子结合，调控miR-363表达。同时，c-Myc的结合能力受启动子甲基化水平的调控。综上所述，我们的研究发现miR-106a-363基因簇具有独特的启动子元件，其CpG岛甲基化水平负调控c-Myc介导的miR-363表达。
以往研究认为 CD20分子具有钙离子通道功能或直接调节钙离子通道活性，钙离子内流对抗CD20单抗介导的细胞凋亡十分重要。然而，有研究发现CD20缺陷的B细胞仍有钙离子内流反应，提示在B细胞中存在其他钙离子调节机制。近期报道B细胞表达一系列钙离子通道蛋白，参与调控细胞内钙离子浓度。我们的研究发现，L-型钙离子通道家族成员CACNA1C在R-CHOP耐药DLBCL患者中低表达，随后的研究显示CACNA1C通过与CD20分子相互作用稳定CD20蛋白结构，抑制CD20蛋白通过泛素化-蛋白酶体途径降解，维持CD20蛋白在 DLBCL肿瘤细胞表面的表达和稳定性，进而影响肿瘤细胞对抗CD20单抗的敏感性。荧光素酶报告试验证实miR-363负调控CACNA1C表达， miR-363过表达导致肿瘤B细胞表面CD20表达降低，诱导抗CD20单抗耐药。多种小分子物质能够调控L-型钙离子通道蛋白的活性，影响钙离子内流和细胞内钙离子浓度，进而调节细胞凋亡过程。我们的体外细胞试验和小鼠模型研究证实 CACNA1C相关的 L-型钙离子通道激动剂能够促进钙离子内流，增加抗CD20单抗诱导的肿瘤细胞凋亡，CACNA1C蛋白表达未受影响，提示L-型钙离子通道激动剂具有增加抗CD20单抗疗效和克服其耐药的潜在能力，L-型钙离子通道拮抗剂具有降低抗CD20单抗疗效和诱导耐药的可能性。
综上所述，本研究创新性发现miR-363高表达与DLBCL免疫化疗耐药相关，miR-106a-363基因簇启动子区高甲基化状态抑制转录因子 c-Myc介导的miR-363表达；L型钙离子通道蛋白CACNA1C通过与CD20蛋白相互作用，维持CD20蛋白在DLBCL肿瘤细胞表面的表达和稳定性；miR-363通过负调控CACNA1C表达导致抗 CD20单抗耐药；L-型钙离子通道调节剂能够影响抗CD20单抗介导的钙离子内流，从而影响其抗肿瘤作用，成为提高疗效的潜在方法。
第一部分：弥漫大B细胞淋巴瘤中miR-363调控机制的研究
目的：
以 DLBCL细胞株为研究对象，研究 miR-363受启动子甲基化调控与DLBCL不良预后的相关性及其机制。
方法：
从UCSC数据库获取miR-106a-363基因簇上游序列，生物信息学方法预测潜在的启动子区及功能元件。在293T细胞株中使用荧光报告基因试验验证所预测启动子的功能。在DLBCL细胞株中使用Western Blotting和ChIP方法检测c-Myc表达及miR-106a-363基因簇启动子与c-Myc结合情况；RT-PCR、BSP法检测不同 DLBCL细胞系 DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨处理前后的miR-106a-363基因簇启动子甲基化水平与miR-363表达的关系。
结果：
1. miR-106a-363基因簇具有独立的启动子结构，位于编码序列上游约4Kb处，荧光报告基因试验证实了该序列具有启动子功能，调控miR-363的转录。
2. miR-106a-363基因簇启动子区 CpG岛存在4个 E-box结构，转录因子c-Myc通过与E-box2区结合调控miR-363表达，该区域甲基化水平与miR-363表达呈负相关。
3.使用 DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨处理 DLBCL细胞可降低miR-106a-363启动子E-box2甲基化水平，上调miR-363表达。
结论：
1. miR-106a-363基因簇具有独立的启动子序列，转录因子c-Myc结合启动子区E-box结构调控miR-106a-363基因簇的转录。
2. DLBCL细胞中 miR-106a-363启动子区 CpG岛甲基化通过抑制 c-Myc与E-box结合负调控miR-363表达。
第二部分：miR-363介导弥漫大B细胞淋巴瘤耐药机制的研究
目的：
以初治DLBCL患者标本、DLBCL细胞株为研究对象，研究miR-363负调控CACNA1C表达与DLBCL细胞对抗CD20单抗耐药的机制。
方法：
以初治DLBCL患者标本为研究对象，检测R-CHOP方案耐药和敏感患者肿瘤细胞CACNA1C蛋白表达水平，分析其与患者预后的相关性。荧光素酶报告试验验证miR-363与CACNA1C表达的相关性。以DLBCL细胞株为研究对象，验证miR-363与CACNA1C表达的相关性及对抗CD20单抗敏感性的影响。构建CACNA1C稳定低表达细胞株，检测对抗CD20单抗疗效的影响。构建小鼠移植瘤模型，观察CACNA1C表达与肿瘤生长和对抗CD20单抗敏感性的关系。荧光定量PCR、免疫荧光、免疫共沉淀、Western Blot检测CANCA1C表达与CD20间的关系。使用蛋白酶体抑制剂处理CACNA1C低表达细胞株，检测CD20蛋白变化。使用L-型钙离子通道激动剂Bay K8644和抑制剂尼莫地平处理 OCI-Ly3、OCI-Ly7、OCI-Ly8，流式细胞术检测细胞凋亡，使用 DLBCL患者组织构建小鼠PDX模型，观察L-型钙离子通道调节剂对抗CD20单抗敏感性的影响。构建miR-363过表达和敲除的DLBCL细胞株，体外验证miR-363对CACNA1C的调控和对DLBCL细胞的影响。
结果：
1.CACNA1C低表达与R-CHOP方案耐药和不良生存相关，是R-CHOP方案的独立不良预后因素，但是，CHOP方案治疗的 DLBCL患者中 CACNA1C表达与预后无显著相关性。CACNA1C在正常B细胞发育不同阶段表达存在差异。
2.CACNA1C低表达在体外抑制抗CD20单抗介导的DLBCL细胞凋亡，在小鼠移植瘤模型中抑制抗CD20单抗介导的肿瘤消减。
3.抗CD20单抗处理后B细胞表面CACNA1C和CD20存在相互作用，这种蛋白互作抑制CD20降解，增强CD20蛋白稳定性。
4.体外和小鼠模型研究证实 L-型钙离子通道蛋白调节剂通过调控CACNA1C功能，影响抗CD20单抗介导的钙离子内流，调节DLBCL细胞对抗CD20单抗的敏感性。
5.miR-363负调控CACNA1C表达并引起CD20蛋白表达下降，抑制抗CD20单抗介导的DLBCL细胞凋亡。
结论：
1.miR-363负调控CACNA1C表达，增加CD20蛋白通过蛋白酶体途径降解，介导抗CD20单抗耐药。
2.靶向CACNA1C相关的L-型钙离子通道蛋白调节剂通过调控钙离子内流影响抗CD20单抗的疗效。