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目的:髓核(nucleus pulposus,NP)细胞分离培养、鉴定及增殖特性的研究。探讨聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,Poly(I:C))诱导髓核细胞表达金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)-1/13的作用及信号通路机制。方法:(1)采用胰蛋白酶(Trypsin)与Ⅱ型胶原酶(collagenase Ⅱ)相结合方法,从NP组织中分离、培养NP细胞。(2)以关节软骨(Articular cartilage,AC)细胞为对照,通过荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测相关基因的表达,鉴定体外培养的NP细胞。(3)CCK-8试剂法检测NP细胞体外增殖情况,以PBS为空白对照组检测Poly(I:C)对NP细胞活性的影响。(4)以PBS为空白对照组,Real-time PCR和Weston Blot分别检测Poly(I:C)刺激NP细胞后MMP-1/13基因和蛋白质的表达水平。(5)以PBS为空白对照组,Real-time PCR检测不同Toll样受体(toll-like receptor,TLR)的配体刺激NP细胞后MMP-1/13 m RNA表达水平。(6)羟基氯喹(Hydroxychloroquine,HCQ)、小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)阻断或沉默NP细胞TLR3通路后,以未阻断TLR3通路组为对照,Real-time PCR检测Poly(I:C)刺激NP细胞后MMP-1/13 m RNA的表达水平。(7)si RNA沉默NP细胞MDA-5/RIG-I通路后,以未沉默组为对照,Real-time PCR检测Poly(I:C)刺激NP细胞后MMP-1/13 m RNA表达水平。(8)以PBS为空白对照组,Real-time PCR和ELISA法分别检测Poly(I:C)刺激NP细胞后炎症细胞因子的基因及蛋白质的表达。(9)放线菌酮(Cycloheximid,CHX)抑制细胞因子的合成后,以未抑制组为对照,Real-time PCR法检测Poly(I:C)刺激NP细胞后MMP-1/13 m RNA表达水平。结果:Trypsin预消化NP组织30min后,collagenase Ⅱ继续消化NP组织4hr,可获取足量的NP细胞供实验使用。分离NP组织获取的细胞表达特异性基因COL 2A1和SOX9;相比于关节软骨(Articular cartilage,AC)细胞,NP细胞显著表达PAX1、FOXF1和CA12基因,FBLN1、GDF10和CYTL1基因表达不显著。体外培养NP细胞贴壁生长的对数期为48~72hr。Poly(I:C)浓度在6.25-50μg/ml之间刺激NP细胞8~48hr时,NP细胞的活性不受Poly(I:C)毒副作用影响。Poly(I:C)刺激NP细胞后MMP-1、MMP-3和MMP-13的m RNA表达量升高,而MMP-1、MMP-13的升高最为显著。TLR1-6、TLR9相对应的配体刺激NP细胞后,相对于空白对照组,仅TLR3的配体Poly(I:C)刺激后MMP-1、MMP-13 m RNA的表达量显著升高;TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9的配体刺激NP细胞后,MMP-1、MMP-13 m RNA的表达不显著。Poly(I:C)刺激NP细胞后,MMP-1、MMP-13的m RNA和蛋白质表达相比于对照组表达显著升高。Poly(I:C)刺激NP细胞后呈明显的时间和剂量效应,Poly(I:C)浓度为50μg/ml时刺激NP细胞24hr后,MMP-1、MMP-13的m RNA和蛋白质表达量到达峰值。溶酶体酸化抑制剂羟基氯喹(Hydroxychloroquine,HCQ)预处理NP细胞阻断TLR3通路后,Poly(I:C)刺激NP细胞组(即HCQ+Poly(I:C)组)与未阻断TLR3通路组(Poly(I:C)直接刺激组)相比MMP-1、MMP-13的m RNA表达水平降低。小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)沉默TLR3后Poly(I:C)刺激NP细胞组(si RNA+Poly(I:C)组)与未沉默TLR3组(Poly(I:C)直接刺激组)相比MMP-1、MMP-13的m RNA表达水平降低。Si RNA分别沉默MDA-5/RIG-I后,Poly(I:C)刺激NP细胞沉默组(si RNA+Poly(I:C)组)与未沉默MDA-5/RIG-I组(Poly(I:C)直接刺激组)相比MMP-1、MMP-13的m RNA表达水平无明显差异。Poly(I:C)刺激NP细胞表达炎症细胞因子IL-6、TNF-α。蛋白质合成抑制剂放线菌酮(Cycloheximid,CHX)可抑制IL-6、TNF-α等炎症细胞因子(Inflammatory cytokines)的产生;CHX预处理髓核细胞后Poly(I:C)刺激髓核细胞组(CHX+Poly(I:C)组)与直接刺激组(Poly(I:C)组)相比MMP-1、MMP-13的m RNA表达水平减少。结论:通过Trypsin预消化与collagenase Ⅱ相结合的方法消化髓核组织,可获取足够数量的髓核细胞供实验使用。NP组织中分离、获取的细胞符合NP细胞生物学特性,表达NP细胞标志性基因。之后实验可选择贴壁生长48hr至72hr的髓核细胞进行相关研究。在髓核细胞生物活性不受Poly(I:C)药物浓度及作用时间影响情况下,Poly(I:C)刺激髓核细胞表达MMP-1、MMP-13且呈明显剂量效应和时间效应。Poly(I:C)刺激髓核细胞表达MMP-1、MMP-13依赖于TLR3受体途径,不依赖MDA-5/RIG-I受体途径。Poly(I:C)刺激髓核细胞分泌炎症细胞因子IL-6、TNF-α,且在Poly(I:C)刺激髓核细胞表达MMP-1、MMP-13的过程中,炎症细胞因子可能间接促进和放大MMP-1、MMP-13的表达。